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H2020

KILLINGTYPHI — Ergebnis in Kürze

Project ID: 706040
Gefördert unter: H2020-EU.1.3.2.
Land: Vereinigtes Königreich
Bereich: Gesundheit, Grundlagenforschung

Mit Faktoren von Tieren Typhus beim Menschen besser vorbeugen

Typhus kann tödlich sein – aber nur für den Menschen. Da das für diese zuweilen verheerende Krankheit verantwortliche Bakterium keine anderen Spezies befällt, haben Forscher versucht, die entsprechenden Gene zu finden und Tieren zu entnehmen, um neue Behandlungsmethoden zu entwickeln.
Mit Faktoren von Tieren Typhus beim Menschen besser vorbeugen
Salmonella Typhimurium (S. Typhi) verursacht ausschließlich beim Menschen typhoides Fieber. Dieses Phänomen nennt man Wirtsbeschränkung. Die Bakterien leben in Makrophagen, also Zellen des Immunsystems, die Krankheitserreger abtöten sollen, und verursachen eine Infektion mit hohen sozioökonomischen Kosten, der jedes Jahr 200 000 Patienten zum Opfer fallen.

Bei jüngsten Forschungsarbeiten wurde bei Mäusen ein antimikrobielles System gefunden, das notwendig ist, um das Wachstum von S. Typhi in Makrophagen zu bremsen, und zur Wirtsbeschränkung des S. Typhi beiträgt. Doch trotz dieses großen Durchbruchs bleiben die molekularen Mechanismen, die die Makrophagen nutzen, um S. Typhi abzutöten, sowie ihre Rolle bei der Anpassung an den menschlichen Wirt weiter unklar.

Notwendige Faktoren zum Abtöten des S. Typhi

Das EU-finanzierte Projekt KILLINGTYPHI hat die Bedingungen für eine groß angelegte Genomanalyse für einen kleineren Maßstab optimiert. Das Ziel sind Genfamilien, von denen man weiß, dass Salmonellen und andere Pathogene sie nutzen, um Krankheiten auszulösen, nämlich RabGTPasen und Deubiquitinasen. „Außerdem wollten wir die Faktoren bewerten, die nachweislich auf das Überleben bakterieller Krankheitserreger in Makrophagen Einfluss haben und ihre Rolle für den Ausgang der Infektion mit S. Typhi untersuchen“, sagt Projektkoordinatorin Prof. Stefania Spano.


Durch den geschickten Einsatz von zwei topmodernen Technologien heben sich diese Forschungsarbeiten von anderen ab. Mit der CRISPR/Cas9-Methode können Gene unter Beobachtung sehr schnell, günstig und präzise verändert werden. Small hairpin RNA (shRNA) wurde eingesetzt, um die Aktivität der Zielgene in Wirtszellen auszuschalten. Der leitende wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Virtu Solano-Collado betont: „Die shRNA-Technologie wurde bisher kaum bei Krankheitserregern verwendet und noch nie bei Salmonellen. Außerdem wurde CRISPR/Cas9 noch nie eingesetzt, um Fragen zu klären, die direkt mit der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserreger zu tun haben.“

Unverzerrte Silencing-Analyse bei Mäusemakrophagen gelungen

Die Forscher nutzten Makrophagen aus dem Knochenmark (bone-marrow derived macrophages, BMDMs) von Mäusen und shRNA-Moleküle, um die Expression von Wirtsgenen zu stoppen und anhand dessen die Infektionsraten mit S. Typhi zu untersuchen. Die beste Übertragungsmöglichkeit für die shRNA lief über Partikel des Lentivirus, wobei die Infektion mit dem Lentivirus optimiert war.

Um die Infektionsstärke zu messen, kreierte KILLINGTYPHI einen fluoreszierenden Stamm des S. Typhi, der eine Kopie des mCherry-Gens trägt – dieser leuchtet angenehm rot. „Der neue Stamm wurde nach mehreren gescheiterten Versuchen in Zusammenarbeit mit Prof. Leigh Knodler, dem Experten der Paul G. Allen School for Global Animal Health in Washington, entwickelt“, erklärt Dr. Solano-Collado. Mit weiteren mikroskopischen und flusszytrometrischen Analysen konnte die jeweilige Infektionsstärke gemessen werden.

Die Forscher im Projekt erreichten dank mCherry mehrere Meilensteine. „Wir können Zellen mit nur einem oder zwei Bakterien pro Zelle von nicht infizierten Zellen (keine Bakterien) unterscheiden“, merkt Dr. Solano-Collado an.

Mit einer anderen kleinen, aber wichtigen Feinjustierung der Methode konnten die Ergebnisse deutlich verbessert werden: die Vernetzung von DNA, die durch das Paraformaldehyd bei der Reparatur von Zellen entsteht, wird rückgängig gemacht. Die Forscher können jetzt mit nur 2 000 Zellen DNA-Produkte erstellen, die sich zur Sequenzierung eignen.

Die Gene selbst im Mittelpunkt

Parallel zur Untersuchung mit shRNA haben die Projektforscher die Wirkung zweier bekannter antimikrobieller Mechanismen von Makrophagen zur Abtötung von S. Typhi in Mäusezellen bewertet: Kupfertransport und das Cathelicidin-ähnliche antimikrobielle Peptid (CRAMP). Kupfer wird nachweislich von einem Transporter namens ATP7A in die Zellkompartimente gebracht, die Krankheitserreger enthalten.

Bisher haben die gewonnenen Ergebnisse gezeigt, dass das Fehlen von CRAMP oder eine Verminderung von ATP7A bei Mäusen keinen Einfluss auf das Überleben von S. Typhi in Makrophagen hat. Die Ergebnisse dieser Untersuchung werden aktuell noch weiter analysiert.

Nächste Schritte im Kampf gegen eine tödliche Krankheit

„Sobald die Sequenzierung der Daten der kleinen Untersuchung abgeschlossen ist, können wir mit der genomweiten Untersuchung beginnen. Deren Ergebnisse bilden dann die Grundlage für zukünftige Fördermittel, mit denen wir unsere Arbeiten fortsetzen können“, erklärt Dr. Solano-Collado.

Prof. Spano betont abschließend die signifikante Wirkung, die KILLINGTYPHI langfristig auf die Gesellschaft haben kann: „Wir gehen davon aus, dass mit unseren Ergebnissen alternative Medikamente gefunden oder wirksamere Impfstoffe gegen S. Typhi entwickelt werden können, um Infektionen zu verhindern. Bei der Geschwindigkeit, mit der sich Infektionskrankheiten auf der Welt ausbreiten können, hat dies absolute Priorität.“

Schlüsselwörter

KILLINGTYPHI, S. Typhi, Makrophagen, Typhus, Untersuchung, shRNA, CRISPR/Cas9
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