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H2020

KILLINGTYPHI — Risultato in breve

Project ID: 706040
Finanziato nell'ambito di: H2020-EU.1.3.2.
Paese: Regno Unito
Dominio: Salute, Ricerca di base

Fattori animali potrebbero aiutare a comprendere come prevenire la febbre tifoide negli esseri umani

La febbre tifoide può essere fatale, ma solo agli esseri umani. Dal momento che il batterio responsabile di questa malattia a volte devastante non è in grado di infettare altre specie, i ricercatori si sono messi alla ricerca dei geni responsabili per rimuoverli dagli animali e sviluppare nuove terapie.
Fattori animali potrebbero aiutare a comprendere come prevenire la febbre tifoide negli esseri umani
Salmonella Typhi (S. Typhi) provoca la febbre tifoide, ma solo negli esseri umani, per un fenomeno noto come restrizione dell’ospite. Visto che vive nei macrofagi, ossia le cellule del sistema immunitario dedite all’annientamento degli agenti patogeni, il costo socioeconomico di questa infezione è elevato, provocando la morte di oltre 200 000 pazienti ogni anno.

Recenti ricerche hanno scoperto un percorso antimicrobico nel topo che è necessario per limitare la crescita di S. Typhi nei macrofagi e contribuisce alla restrizione dell’ospite di S. Typhi. Nonostante questa importante scoperta, i meccanismi molecolari utilizzati dai macrofagi per annientare S. Typhi e il loro ruolo nell’adattamento all’ospite umano rimangono sconosciuti.

I fattori necessari per annientare S. Typhi

Il progetto KILLINGTYPHI, finanziato dall’UE, ha ottimizzato le condizioni per una vasta analisi a livello di genoma su scala ridotta. Obiettivo, le famiglie di geni note per essere sfruttate da Salmonella e da altri agenti patogeni per provocare la malattia, e gli enzimi Rab GTPasi e deubiquitinasi. «Volevamo inoltre valutare i fattori noti per avere un impatto sulla sopravvivenza dei batteri patogeni nei macrofagi e studiare il loro ruolo nel risultato dell’infezione da S. Typhi», afferma la prof.ssa Stefania Spano, coordinatrice del progetto.


L’uso ingegnoso di due tecnologie all’avanguardia differenzia la ricerca in oggetto delle altre. CRISPR/Cas9 è un modo molto veloce, economico ed accurato di modificare geni sotto sorveglianza. Sono stati utilizzati piccoli RNA a forcina (shRNA) per arrestare l’attività dei geni bersaglio nelle cellule ospiti. In qualità di borsista che ha condotto la ricerca, il dott. Virtu Solano-Collado sottolinea: «La tecnologia shRNA è stata raramente adoperata con agenti patogeni e mai con Salmonella. Inoltre, CRISPR/Cas9 non è mai stato utilizzato prima per decifrare le questioni direttamente correlate alle interazioni ospite-patogeno».

Raggiunta un’analisi di silenziamento imparziale nei macrofagi di topo

Utilizzando macrofagi derivati​ dal midollo osseo (BMDM) di topo e molecole di shRNA per arrestare l’espressione di geni ospiti, i ricercatori hanno studiato i tassi di infezione con S. Typhi. Il modo migliore per fornire shRNA era tramite particelle di lentivirus con l’infezione lentivirale ottimizzata.

Per valutare il livello di infezione, KILLINGTYPHI ha creato un ceppo di S. Typhi fluorescente che trasporta una copia del gene mCherry e brilla di un bel colore rosso. «Il nuovo ceppo è stato sviluppato in collaborazione con l’esperto prof. Leigh Knodler della Paul G. Allen School for Global Animal Health, Washington, dopo diversi tentativi falliti», spiega il dott. Solano-Collado. Ulteriori analisi di microscopia e di citometria a flusso hanno aiutato a misurare i livelli di infezione.

Diversi traguardi sono stati raggiunti e superati dai ricercatori del progetto utilizzando mCherry. «Siamo in grado di distinguere cellule contenenti fino a un minimo di 1 o 2 batteri per cellula da cellule non infette (assenza di batteri)», sottolinea il dott. Solano-Collado.

Un altro piccolo ma significativo aggiustamento del metodo che migliora enormemente i risultati è quello di invertire la reticolazione del DNA provocata dalla paraformaldeide utilizzata per fissare le cellule. I ricercatori possono ora utilizzare solo 2 000 cellule per ottenere prodotti DNA sequenziabili.

Osservazioni sugli stessi geni

In parallelo allo screening shRNA, i ricercatori del progetto hanno valutato l’effetto di due meccanismi antimicrobici macrofagici noti nell’annientamento di S. Typhi nelle cellule di topo: il trasporto di rame e il peptide antimicrobico relativo alla catelicidina (CRAMP). È noto che il rame viene fornito ai compartimenti contenenti agenti patogeni da un trasportatore denominato ATP7A.

Ad oggi, i risultati ottenuti hanno dimostrato che l’assenza di CRAMP o la deplezione di ATP7A non hanno alcun impatto sulla sopravvivenza di S. Typhi nei macrofagi di topo. I risultati di questo screening sono attualmente in fase di ulteriore analisi.

I passi successivi per combattere una malattia mortale

«Non appena i dati di sequenziamento dal piccolo screening saranno finiti, saremo pronti per avviare lo screening dell’intero genoma. I risultati di ciò costituiranno la base delle future borse di studio per continuare il nostro lavoro», spiega il dott. Solano-Collado.

La prof.ssa Spano conclude con l’impatto significativo che KILLINGTYPHI promette di avere sulla società nel lungo termine. «Ci aspettiamo che i nostri risultati aiuteranno a trovare farmaci alternativi o a sviluppare vaccini più efficaci contro S. Typhi per prevenire l’infezione. Data la velocità con cui le malattie infettive possono diffondersi nel mondo, tutto questo è di primaria importanza».

Keywords

KILLINGTYPHI, S. Typhi, macrofago, febbre tifoide, screening, shRNA, CRISPR/Cas9