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FP7

MAPKMOOD — Ergebnis in Kürze

Project ID: 251864
Gefördert unter: FP7-PEOPLE

Neue Erkenntnisse zum MAPK-Signalweg

Obwohl affektive Störungen wie Angst und Depression in der Bevölkerung zunehmen, ist noch wenig über die molekularen und intrazellulären Signalmechanismen wie den MAP-Kinase (mitogen-aktivierte Proteinkinase)-Signalweg bekannt.
Neue Erkenntnisse zum MAPK-Signalweg
Das EU-finanzierte Forschungsprojekt MAPKMOOD untersuchte den MAPK-Signalweg an Tiermodellen und Zellkulturen und entwickelte ERT2 (Östrogenrezeptor T2)-Fusionsproteine für die reversible Genaktivierung und Hemmung mittels 4OHT (4-Hydroxy-Tamoxifen). Nach Stimulation mit 4OHT und PMA (Phorbol-12-Myristat 13-Azetat) wurden auch die Aktivitäten von ERK (extrazelluläre signalregulierte Kinasen) und MKP (MAPK-Phosphatasen) untersucht.

Generiert wurden Zelllinien mit spezifischen Mutationen in den Proteinen Braf, V637E und K519M, die mit ERT2 Fusionsproteine bilden, an denen mittels 4OHT extern die Genexpression moduliert werden kann. Die BrafV637E–ERT2-Zellkulturen zeigten nach Gabe von 4OHT eine höhere Konzentration aktivierter, phosphorylierter ERK1 und ERK2 (pERK1/2). PMA in Kombination mit 4OHT senkte die pERK1/2-Aktivität in MAPK-Signalwegen von BrafK519M–ERT2-Zellkulturen. Durch alleinige Gabe von PMA konnte ERK jedoch wieder aktiviert werden. Mittels immunhistochemischer Färbung wurde die stimulierende bzw. hemmende Funktion von OHT im MAPK-Signalweg bestätigt. Ähnliche Resultate waren bei Fibroblasten zu beobachten, die die Fusionsproteine MKP1C258S–ERT2 oder MKP1WT–ERT2 exprimierten. Diese Experimente demonstrierten überzeugend, dass ERT2-Fusionsproteine die MAPK-Signalgebung und Kinaseenzymkonzentration mittels 4OHT reversibel kontrollieren können.

Die Forscher von MAPKMOOD generierten erfolgreich doppelt-transgene Mausmodelle durch Kreuzung von BrafV637E–ERT2-Mäusen mit Nestin-Cre- und Rosa-cre-Mäusen für In-vivo-Tests. Die BrafV637E–ERT2 x Nestin-cre-Mäuse exprimierten die BrafV637E–ERT2-Fusionsproteine im Gegensatz zu den BrafV637E–ERT2 x Rosa-cre-Mäusen nur im Gehirn. Eine Aktivierung von ERK1 und ERK2 nach Gabe von 4OHT wurde zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet, nach 24 Stunden war allerdings die Baseline wieder erreicht, was durch Western-Blot bestätigt wurde. Erwartungsgemäß zeigten die BrafV637E–ERT2 x Nestin-cre-Mäuse ausschließlich im Gehirn eine starke Expression von Fusionsproteinen, BrafV637E–ERT2 x Rosa-cre-Mäuse hingegen eine verstärkte Aktivierung des MAPK-Signalwegs in allen getesteten Organen.

Im Ergebnis konnte die MAPK-Signalgebung erfolgreich durch Regulierung der Phosphataseaktivität und der Kinaseenzymkonzentration mittels 4OHT auf zellulärer und Zellkernebene gesteuert werden. Somit steht nun eine effektive Methode zur Analyse akuter und chronischer Kinaseveränderungen in den einzelnen Entwicklungsstadien, Organen und Zelllinien zur Verfügung, was die Rolle von MAPK als Auslöser von Krankheiten und im physiologischen Zustand aufzeigt und neue Möglichkeiten für Therapien schafft.

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