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FP7

MAPKMOOD — Resultado resumido

Project ID: 251864
Financiado con arreglo a: FP7-PEOPLE

El esclarecimiento de la vía MAPK

Los trastornos del estado de ánimo como la ansiedad y la depresión son problemas de salud comunes. Pese a ello, se conocen pocos detalles sobre mecanismos moleculares e intracelulares de señalización implicados en los mismos como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK).
El esclarecimiento de la vía MAPK
Los socios del proyecto financiado por la Unión Europea MAPKMOOD estudiaron la vía MAPK utilizando modelos animales y cultivos celulares. Para ello, los investigadores desarrollaron proteínas de fusión con el dominio de unión a ligando del receptor nuclear de estrógenos T2 (ERT2), lo que hace posible la activación y la inhibición de genes reversible mediante la administración del fármaco 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT). Además estudiaron las actividades de las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) y de las MAPK fosfatasas (MKP) a partir de la estimulación con 4OHT y aceto-miristato de forbol (PMA).

Por otra parte, crearon líneas celulares específicas con mutaciones en las proteínas Braf, K519M y V637E para formar proteínas de fusión con ERT2 que les permitieran modular externamente los genes con 4OHT. Tras administrar 4OHT a los cultivos de líneas celulares BrafV637E-ERT2, los investigadores constataron un fuerte aumento de los niveles de ERK1 y ERK2 activados y fosforilados (pERK1/2). Los niveles de actividad pERK1/2 de los cultivos celulares BrafK519M-ERT2 que recibieron PMA y 4OHT eran inferiores a los de los cultivos tratados únicamente con PMA. Los experimentos de inmunotinción confirmaron el papel estimulatorio o inhibitorio del 4OHT en la vía de señalización MAPK. Los miembros del consorcio obtuvieron resultados similares en los fibroblastos que expresaban las proteínas de fusión MKP1C258S-ERT2 o MKP1WT-ERT2. Estos experimentos demostraron de manera concluyente que mediante la inducción del 4OHT, las proteínas de fusión ERT2 pueden controlar de manera reversible la señalización MAPK y los niveles de la enzima quinasa.

Para poder controlar in vivo la señalización MAPK, los socios del proyecto generaron modelos de ratones transgénicos dobles, cruzando ratones BrafV637E-ERT2 con ratones Nestin-cre y Rosa-cre. A continuación, comprobaron que los ratones BrafV637E-ERT2 x Nestin-cre expresaban las proteínas de fusión BrafV637E-ERT2 sólo en el cerebro, a diferencia de los ratones BrafV637E-ERT2 x Rosa-cre que las expresan en distintos órganos. Los investigadores inyectaron 4OHT a ambos tipos de ratones y analizaron mediante Western Blot los niveles de ERK1 y ERK2 activado y fosforilado en diferentes momentos y el retorno a los valores basales.

Como era de esperar, los ratones BrafV637E-ERT2 x Nestin-Cre mostraron una fuerte expresión de las proteínas de fusión sólo en el cerebro, mientras que en los ratones BrafV637E-ERT x Rosa-Cre se produjo una fuerte activación de la señalización MAPK en todos los órganos estudiados.

En resumen, utilizando proteínas de fusión ERT y aplicando un tratamiento con 4-OHT, los investigadores lograron controlar la señalización MAPK y la regulación de la actividad fosfatasa en los niveles celular y nuclear. De este modo han conseguido desarrollar una herramienta potente que les facilitará el estudio de los efectos de las alteraciones en los niveles de quinasas, tanto agudas como crónicas, en diferentes estados de desarrollo, órganos y líneas celulares. Esto permitirá aclarar el papel de las funciones de la señalización MAPK en la salud y en la enfermedad y proporcionará nuevas dianas terapéuticas.

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