Virusinfektionen an der empfindlichsten Stelle treffen
Das dynamische Verhältnis zwischen Viren und den Wirtszellen, die sie befallen, wird von bestimmten Kohlenhydraten, nämlich Glykanen, sowie glykan-bindenden Proteinen (GBP) dominiert. Diese komplexen Interaktionen kontrollieren das Eindringen des Virus in die Zelle, die Virusvermehrung in der Zelle und das Entdecken des Virus durch das Immunsystem des Wirts, gegebenenfalls gefolgt von einer Neutralisierung und Eliminierung der Infektion. Glykananalysen sind technisch sehr anspruchsvoll und waren bisher nur Thema einer einzigen Studie. An dieser Untersuchung beteiligte Partner haben sich jetzt im EU-finanzierten Projekt HTP-GLYCOMET zusammengeschlossen. Gemeinsam mit der koordinierenden Einrichtung UNIRI und drei weiteren Partnern, die ergänzende Erfahrungen mit Glykanen und deren Bindungsmolekülen mitbringen, haben sie im Verständnis der Schlüsselprozesse von Immunität und Virusinfektionen große Fortschritte gemacht. Glykane und ihr breites Anwendungsspektrum Innerhalb der Arbeitsgruppe gab es Experten zu einer großen Breite an Themenbereichen. Dazu gehörten die Herstellung von speziellen monolithischen chromatographischen Werkzeugen für die Hochdurchsatz-Fraktionierung komplexer biologischer Flüssigkeiten, die Reinigung der Proteine von Körperflüssigkeiten und Membranproteinen, die glykomische Hochdurchsatzanalyse per Chromatographie und Multiplex-Kapillargelelektrophorese sowie schließlich Expertise im Bereich der Virusimmunologie. Aus den Forschungsarbeiten sind über 25 wissenschaftlich begutachtete Artikel entstanden, die sich über ein breites Themenspektrum erstreckten: von Influenza A bis zu Glykolisierungsmustern von Patienten, die sich einer bildgesteuerten Tumorablation unterzogen. Hochdurchsatz als wichtigster Lösungsweg Die Forscher bei HTP-GLYCOMET haben für die Untersuchung der Proteinglykosylierung eine Hochdurchsatzmethode entwickelt. „Diese haben wir dann für die Analyse der posttranslationalen Proteinmodifikationen (PTM) von Membranproteinen in Serum und Plasma genutzt“, erklärt Prof. Djuro Josic, Koordinator von HTP-GLYCOMET. Das Team untersuchte Influenzaviren und den Murinen Cytomegalievirus von Mäusen. Dabei konnte es erfolgreich monoklonale Antikörper herstellen und Hochdurchsatzverfahren für die Antikörperreinigung etablieren. Anhand der anschließenden Isolierung von seltenen Proteinen in Serum und Membranen sowie der Optimierung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie konnten die Glykoproteine und ihre dazugehörigen Glykanstrukturen identifiziert und charakterisiert werden. Die Forschung im Projekt stand vielen Herausforderungen gegenüber und verlangte den wissenschaftlichen Partnern Intuition und Erfahrung ab. Die Isolierung der Membranproteine und die Charakterisierung ihrer Glykanbestandteile gestalteten sich zuweilen schwierig. Eine Lösung fanden Sie in der Optimierung der Solubilisierung und der enzymatischen Entglykosylierung von stark glykosylierten und hydrophoben Proteinen. Ein weiteres Problem lag im Aktivitätsverlust der monoklonalen Antikörper nach ihrer Immobilisierung. Mit der mühevollen Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper und der chemischen Optimierung der Immobilisierung konnten die Forscher auch dieses Problem lösen. Eine strahlende Zukunft für die Glykoproteinforschung Nach den zukünftigen Arbeiten gefragt, fasst Prof. Josic zusammen: „Wir werden weiter an der Hochdurchsatz-Isolierung von Glykomembranproteinen in Serum und Plasma arbeiten sowie an der Analyse von Änderungen der Glykolisierung bei pathogener Veränderung.“ Zum möglichen Markteintritt der Glykoproteinanalyse sagt er: „Die neue Immobilisierungstechnologie für Proteine auf der Oberfläche monolithischer Stützen und neu entwickelter ELISA-Platten mit 96 monolithischen Scheiben wird für die Hochdurchsatzanalyse von Glykoproteinen im Serum kommerziell genutzt werden.“ Diese Scheiben mit dem immobilisierten Protein L sind auf die Hochdurchsatz-Isolierung verschiedener Immunoglobuline ausgerichtet, hauptsächlich IgG, IgM und IgA. Das Projekt HTP-GLYCOMET hat in einem Bereich, der bisher wegen technischer Schwierigkeiten bei der Arbeit mit Glykoproteinen unerforscht geblieben war, große Fortschritte gemacht. Die Arbeiten bilden eine solide Wissensbasis für die Abbildung von Glykan bei einer Infektion und die weiterführende Entwicklung einer dedizierten Glykan-Datenbank. Die Ergebnisse könnten in der Biomedizin bei der Entwicklung neuer Medikamente oder Impfstoffe angewandt werden, bei der Wirkungsanalyse von Operationen oder therapeutischen Maßnahmen sowie bei der Entwicklung innovativer personalisierter Therapien.
Schlüsselbegriffe
HTP-GLYCOMET, Glykan, Hochdurchsatz, Glykoprotein, Virus
