Enkele-molecuulbiofysica in het tijdperk van hoge doorvoer
De mogelijkheid om grote bibliotheken van DNA-, RNA- en eiwitsequenties op het enkele-molecuulniveau te bestuderen is al lang een cruciaal doel in de biofysica, een doel dat nieuwe dimensies van moleculair begrip belooft te ontsluiten. “Doordat onderzoekers de dynamiek en interacties van individuele moleculen kunnen onderzoeken, zouden dergelijke studies een diepgaander begrip van biologische processen opleveren,” zegt Chirlmin Joo(opens in new window), biofysicus aan de Technische Universiteit Delft(opens in new window). “Het zou ook de deur openen naar nieuwe manieren om genetische aandoeningen, kanker en andere ziekten te behandelen.” Het MIGHTY_RNA-project, dat steun kreeg van de Europese Onderzoeksraad(opens in new window), helpt deze langdurige beperking te overwinnen. De kern van dit initiatief is SPARXS, een innovatief platform dat enkele-molecuulfluorescentiemetingen integreert met volgende-generatie-sequentiebepaling om sequentiespecifieke biofysische studies met hoge doorvoer mogelijk te maken. “Deze baanbrekende oplossing maakt de gelijktijdige kinetische en structurele karakterisering van miljoenen moleculen met duizenden unieke sequenties mogelijk,” legt Joo uit, waardoor het begrip van hun vorm en gedrag wordt versneld.
Uitdagingen overwinnen
Voor de ontwikkeling van het SPARXS-platform moesten de onderzoekers verschillende uitdagingen overwinnen. Een daarvan was het garanderen van de compatibiliteit van de enkele-molecuulfluorescentiedetectie en de sequentiebepalingsprocessen op dezelfde commerciële sequentiebepalingsdoorstroomcel. In het begin waren de onderzoekers er niet eens zeker van of dit wel zou werken, omdat ze geen directe controle hadden over de omstandigheden in een sequentiebepalingsdoorstroomcel. “Om in die omgeving enkele-molecuulfluorescentie [vrij van achtergrondruis] te bereiken, moesten detectiestrategieën van de grond af aan opnieuw worden uitgedacht,” merkt Joo op. “Het was een grote sprong die SPARXS mogelijk maakte.” Om de enorme gegevenssets van de fluorescentiemicroscopie en de sequentiebepalingsmodaliteiten op elkaar af te stemmen, moest het project bovendien aangepaste algoritmen ontwikkelen die een nauwkeurige gegevenskoppeling konden uitvoeren. De gegevenssets, samen met alle software die in het project is gebruikt, zijn openlijk toegankelijk(opens in new window).
Eén experiment, duizenden unieke sequenties
Met SPARXS konden onderzoekers het kinetisch gedrag van meer dan 4000 unieke DNA-sequenties in één enkel experiment bestuderen. Volgens Joo onthult dit werk niet alleen nieuwe inzichten in sequentie-afhankelijke moleculaire dynamica, maar biedt het ook een robuust, generaliseerbaar raamwerk dat kan worden toegepast om eiwitten, RNA en andere biomoleculen te bestuderen. “SPARXS opent nieuwe wegen voor het begrijpen van sequentie-structuur-functierelaties op een ongekende schaal, en het zien dat dit concept materialiseert en experimenteel gevalideerd wordt was een keerpunt in mijn carrière,” voegt hij eraan toe.
Hoe sequentievariaties moleculair gedrag beïnvloeden
Het MIGHTY_RNA-project heeft de grens van de enkele-molecuulbiofysica verlegd naar het hoge-doorvoerdomein – en het is van plan om te blijven pushen. Onderzoekers zijn momenteel bezig om het gebruik van SPARXS uit te breiden tot andere toepassingen dan nucleïnezuren, door het aan te passen voor het bestuderen van eiwit-ligand- en eiwit-peptide-interacties. Het project onderzoekt ook de mogelijkheid om SPARXS-gegevens te integreren met machine-learning-benaderingen. Een dergelijke combinatie zou het platform in staat kunnen stellen om moleculaire interacties en dynamica te voorspellen en zo het gebruik ervan bij het ontdekken van medicijnen en synthetische biologie te verbeteren. “Door de resolutie van enkele-molecuultechnieken te combineren met de schaal van hoge-doorvoerbenaderingen, stelt het SPARXS-platform onderzoekers in staat om systematisch te onderzoeken hoe sequentievariaties moleculair gedrag beïnvloeden, met toepassingen variërend van fundamentele biofysica tot translationeel biomedisch onderzoek,” concludeert Joo. Hij verwelkomt vragen(opens in new window) van potentiële medewerkers die SPARXS willen toepassen op andere biologische systemen.
