Objetivo
Smooth muscle contractility is controlled by regulatory proteins associated with the myosin and acting filaments. Whilst activation of myosin by Ca2+ dependent phosphorylation is the primary regulator in all smooth muscles, tonic smooth muscles (e.g. vascular smooth muscle, airway smooth muscle) are also regulated by the 'chemoreceptor' pathway, which involves cell signalling kinases and phosphorylation of target nuclear and cytoplasmic proteins. Caldesmon is the regulatory protein of the thin filaments; it inhibits contractile activity and it is regulated by Ca2+-calmodulin and also by phosphorylation. The Moscow laboratory has recently established that at least 90% of caldesmon phosphorylation in vivo is due to MAP kinase. In mammalian caldesmon there are three potential MAP kinase sites: Thr730, Ser759 and Ser799 (absent in chicken). Whilst much investigation has been concentrated on the effects of Ser759 phosphorylation, recent results form the Moscow lab indicate that in vivo the predominant site of phosporylation in PdBu-stimulated arterial smooth muscle is probably Thr730, however there may be more additional N-terminal sites.
It is proposed to study the physiological, functional and structural consequences of caldesmon phosphorylation. The initial task of this study will be to determine accurately the in vivo phosphorylation sites of caldesmon under physiological stimulation.
The assignment of sites will be confirmed by phosphorylating deletion mutants of caldesmon containing just one of the identified sites with MAP kinase in vitro. It is then planned to develop a phosphospecific antibody to each site to monitor intracellular interactions of caldesmon and the level of agonist-stimulated phosphorylation of caldesmon. This will be used to explore the contribution of site-specific phosphorylation in regulation of smooth muscle contraction/relaxation by caldesmon.
The functional effects of Thr730 phosphorylation on actomyosin interaction will be investigated in vitro by ATPase and in vitro motility assays using well-characterised deletion mutants of caldesmon. Specific phosphorylation will be achieved by making Ser/Thr>Ala point mutants. It is expected that phosphorylation will reduce inhibitory function and interaction with Ca2+-calmodulin and that this will primarily affect the cooperativity of the regulated thin filament. The effects of phosphorylation on the structure of caldesmon domain 4 will be determined by high-resolution protein NMR and the effect on caldesmon-actin interaction will be studied by heteronuclear NMR, SPR and by the unique method of Dr Borovikov, which detects conformational changes in actin molecules in ghost fibres, which have an intact actin filament lattice. The functional effects of caldesmon phosphorylation on contractility in a more physiological system will be tested in chemically skinned smooth muscle fibres by replacing native caldesmon with recombinant caldesmon deletion mutants and specifically phosphorylated caldesmon mutants.
Ámbito científico (EuroSciVoc)
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Programas de financiación plurianuales que definen las prioridades de la UE en materia de investigación e innovación.
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Las convocatorias de propuestas se dividen en temas. Un tema define una materia o área específica para la que los solicitantes pueden presentar propuestas. La descripción de un tema comprende su alcance específico y la repercusión prevista del proyecto financiado.
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Convocatoria de propuestas
Procedimiento para invitar a los solicitantes a presentar propuestas de proyectos con el objetivo de obtener financiación de la UE.
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Régimen de financiación
Régimen de financiación (o «Tipo de acción») dentro de un programa con características comunes. Especifica: el alcance de lo que se financia; el porcentaje de reembolso; los criterios específicos de evaluación para optar a la financiación; y el uso de formas simplificadas de costes como los importes a tanto alzado.
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Datos no disponibles
Coordinador
N6 6NT London
Reino Unido
Los costes totales en que ha incurrido esta organización para participar en el proyecto, incluidos los costes directos e indirectos. Este importe es un subconjunto del presupuesto total del proyecto.