Aprovechar el flujo intracelular de electrones
El proceso de transferencia de electrones ocurre en mitocondrias y cloroplastos y en organismos unicelulares como las bacterias. Los electrones se transfieren desde un compuesto que se oxida porque pierde electrones a un compuesto que se reduce porque gana electrones. Estas reacciones de oxidación-reducción (redox) constituyen una parte esencial del ciclo energético. Las técnicas de registro de moléculas individuales más avanzadas han sido aplicadas a estructuras moleculares más grandes, como el ADN. Sin embargo, los investigadores del proyecto financiado por la Unión Europea SINGLE-BIOET (Single-molecule junction capabilities to map the electron pathways in redox bio-molecular architectures) se propusieron estudiar las rutas de transferencia secuencial de electrones en una estructura biomolecular única. El cobre de la azurina, una metaloproteína bacteriana cuproproteína de color azul, sufre un proceso de oxidorreducción asociado a su cadena de transporte de electrones. Los investigadores emplearon la mutagénesis dirigida para modificar residuos concretos en la superficie externa de esta proteína con motivos que mejoran su capacidad de unión de molécula única. De este modo crearon puntos de unión de una sola molécula en estos sitios de la cubierta externa de la proteína azurina para estudiar los parámetros dominantes en la cadena de transferencia de electrones. Los investigadores desarrollaron en su laboratorio la técnica experimental de la mutagénesis dirigida para crear enlaces de una molécula única. Los resultados de este procedimiento experimental se evaluaron mediante técnicas fluorescentes y electroquímicas. También se midió la conductancia en la azurina mutante y de tipo silvestre, obteniendo así información valiosa sobre el empleo de esta técnica experimental y del transporte de electrones. Las diferencias en la conductancia entre la proteína de tipo silvestre y mutante demostraron la posibilidad de modular el transporte de cargas en dispositivos moleculares a escala nanométrica mediante modificaciones puntuales simples de los esqueletos biomoleculares. El método de la mutagénesis dirigida permitió seleccionar nueve mutantes finales de la azurina con diferentes modificaciones en los residuos de su superficie externa. En este contexto, todos los mutantes purificados fueron caracterizados para determinar su actividad y plegamiento estructural. La comparación del transporte de electrones entre la proteína silvestre y los diferentes mutantes proporcionó tanto información sobre las rutas de transporte a lo largo de la compleja estructura de la azurina como detalles técnicos sobre la formación de enlaces de proteína única. Las medidas de conductancia de molécula única realizadas en los diferentes mutantes de la proteína revelaron que estos exhiben una menor dispersión en comparación con la proteína de tipo silvestre, un hecho que apunta a la existencia de una orientación más restringida en las variantes de la azurina como resultado de un anclaje más fuerte del tiol a los electrodos de doble unión. Gracias a las mediciones realizadas empleando una técnica de microscopía de efecto túnel de contacto intermitente desarrollada recientemente, se corroboró el aumento del tiempo de vida media de proteína única en los mutantes. Finalmente, se observó que la respuesta de activación electroquímica de los hilos de mutante único era totalmente opuesta a la de su homólogo silvestre, lo que demuestra la idoneidad de modificar mediante bioingeniería el transporte de electrones en un hilo biomolecular a nanoescala. En conjunto, la caracterización de los mecanismos del transporte de electrones tendrá una gran repercusión en el campo de la bioelectrónica. Además, facilitará la integración de estructuras biológicas como componentes en dispositivos optoelectrónicos.
Palabras clave
Transporte de electrones, bioelectrónica, redox, SINGLE-BIOET, metaloproteína azurina
