Cryo-EM Imaging of Histone Recycling at the Replication Fork

Descripción del proyecto

Comprender la maquinaria de replicación eucariota con la ayuda de la microscopía de crioelectrones

El ADN eurcariota está densamente concentrado en matrices nucleosomales para formar cromatina y proteger así el material genético y regular el acceso al ADN. La maquinaria de replicación desmantela los nucleosomas en la horquilla de replicación y vuelve a ensamblarlos en cadenas de ADN activas, que coordinan la deposición de histonas parentales y recién sintetizadas. Las modificaciones postraduccionales de las histonas proporcionan un código epigenético que modula la activación y el silenciamiento de regiones cromosómicas específicas. El proyecto financiado con fondos europeos Cryo-H-Rec emplea microscopía de crioelectrones, espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) de soluciones y espectrometría de masas con entrecruzamiento para estudiar la duplicación del ADN y el reciclaje de las histonas parentales. Estos datos revelarán el papel de los componentes de los replisomas en la reorganización de los nucleosomas en la horquilla de replicación y arrojarán luz sobre los mecanismos moleculares de la replicación cromosómica y la herencia epigenética.

Objetivo

DNA replication is essential for cell proliferation. In eukaryotic cells, DNA is densely packaged in nucleosome arrays that form chromatin. Such organisation protects the genetic material and controls access to DNA, thus providing an important mechanism for regulating gene expression. The eukaryotic replication machinery has evolved to unravel nucleosomes in order to access and duplicate DNA, while also maintaining chromatin density on newly duplicated DNA. To achieve this, the replisome dismantles nucleosomes ahead of the replication fork and reassembles them on nascent DNA strands, by coordinating redeposition of parental and newly synthesized histones. Histone proteins are subject to an array of post-translational modifications (PTMs), providing an epigenetic code that modulates activation and silencing of specific chromosomal regions. Redeposition of parental histones with their PTMs on both nascent DNA strands is, thus, pivotal in transmission of the epigenetic marks to daughter cells. I intend to perform in vitro reconstitution of the replisome on a chromatinised template and use cryo-electron microscopy to image DNA duplication and parental histone recycling at the replication fork. I seek to describe different structural intermediates in the process of nucleosome disassembly, DNA duplication and histone incorporation into new nucleosomes. To capture and characterise intermediate states of the replication machinery during this concerted process, I will employ a multidisciplinary approach and resort to structural techniques complementary to cryo-EM like solution NMR spectroscopy and crosslinking-mass spectrometry (XL-MS). My results will help dissect the role of different replisome components in nucleosome reshuffling at the replication fork, and elucidate the molecular mechanism that underpins chromosome replication and epigenetic inheritance.