Objetivo
MODEL SYSTEM FOR DEVELOPMENT OF RATIONAL APPROACHES FOR PROTEIN ENGINEERING BY COMBINED GENETIC, STRUCTURAL AND MODELLING TECHNIQUES.
THE ADVANTAGE OF BARNASE IS THAT IT IS SUFFICIENTLY SMALL TO BE READILY STUDIED BY N.M.R. AND X-RAY CRYSTALLOGRAPHY. IT CAN BE HOPED THAT A DETAILED STUDY OF THIS PROTEIN WILL LEAD TO THE ELUCIDATION OF RULES GOVERNING PROTEIN FOLDING. THE KNOWLEDGE OF THESE RULES IS A MAJOR BATTLENECK WHICH MAKES IMPOSSIBLE THE DESIGN OF NOVEL PROTEINS.
Research was carried out in order to develop rational approaches for engineering modified protein using genetic engineering techniques. Sequence modifications were made in barnase (a small ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens) to probe the catalytic mechanism in the ribonucleases about which appreciable controversy persists and to dissect the contributions from hydrophobic and electrostatic interactions to protein stability. Mutations were also used as reporter groups in kinetic studies of protein folding to provide information on the conformation of the transition state for unfolding. Crystallographic analysis was performed on the enzyme complex with a deoxydinucleotide inhibitor (dGpC). Molecular modelling was used to help interpret data on protein nucleic acid interactions and catalysis, and contributions of electrostatic and hydrophobic interactions to protein stability were analysed by computer simulations. Interactions of barnase with its intracellular protein inhibitor, barstar, were studied via random mutagenesis of the barstar gene.
Parameters of the enzyme catalyzed reaction were determined for short nucleotides and ribonucleic acid (RNA) substrates, and shown to be significantly different. Residues of barnase responsible for catalysis were established. The structure of the complex of barnase with a deoxydinucleotide inhibitor was solved. It shows an unproductive binding mode for the dinucleotide involving enzyme subsites that are different from the primary recognition site for guanine in related ribonucleases. Based on these results, molecular modelling was used to study the interaction of the enzyme with RNA analogues, and to rationalize the catalytic mechanism. Appreciable progress was made in understanding how hydrophobic and electrostatic interactions contribute to protein stability and on the physical origins of the observed effects. An arginine and a cysteine residue in barstar (respectively in positions 75 and 40) were both identified as participating in the barnase barstar interaction.
1- CLONING OF THE BARNASE GENE BY USING SMALL DNA FRAGMENTS (ALLOWING REASSEMBLING MUTANT PROTEINS BY SUBSTITUTION OF THE SMALL FRAGMENTS) AND AN ALKALINE PHOSPHATASE PROMOTOR/LEADER SYSTEM.
2- KINETIC ANALYSIS TO STUDY THE BASIC INTERACTIONS BETWEEN THE ENZYME AND ITS SUBSTRATE.
3- STUDY BY NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE AND RAPID REACTION KINETICS OF THE FOLDING OF THE PROTEIN.
Ámbito científico (EuroSciVoc)
CORDIS clasifica los proyectos con EuroSciVoc, una taxonomía plurilingüe de ámbitos científicos, mediante un proceso semiautomático basado en técnicas de procesamiento del lenguaje natural. Véas: El vocabulario científico europeo..
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Programas de financiación plurianuales que definen las prioridades de la UE en materia de investigación e innovación.
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Las convocatorias de propuestas se dividen en temas. Un tema define una materia o área específica para la que los solicitantes pueden presentar propuestas. La descripción de un tema comprende su alcance específico y la repercusión prevista del proyecto financiado.
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Convocatoria de propuestas
Procedimiento para invitar a los solicitantes a presentar propuestas de proyectos con el objetivo de obtener financiación de la UE.
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Régimen de financiación
Régimen de financiación (o «Tipo de acción») dentro de un programa con características comunes. Especifica: el alcance de lo que se financia; el porcentaje de reembolso; los criterios específicos de evaluación para optar a la financiación; y el uso de formas simplificadas de costes como los importes a tanto alzado.
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Coordinador
CB2 1EW Cambridge
Reino Unido
Los costes totales en que ha incurrido esta organización para participar en el proyecto, incluidos los costes directos e indirectos. Este importe es un subconjunto del presupuesto total del proyecto.