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Subunit localization of the Drosophila 26S proteasome by means of 3D cryo electron microscopy

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La criogenia se incorpora a los estudios de biología estructural

Grandes complejos proteicos como el proteasoma 26S han sido objeto de numerosos estudios. Sus dos componentes principales son la partícula nuclear y la partícula reguladora.

Salud

El proteasoma 26S es una extensa masa de moléculas compuesta por unas 35 subunidades. Si bien la partícula nuclear (PN) proteolítica se ha investigado de manera exhaustiva, se carece de información acerca de la partícula reguladora (PR). El proyecto 26S Proteasome («Localización de subunidades del proteasoma 26S de la Drosophila por medio de microscopía por crioelectrón tridimensional»), financiado con fondos comunitarios, tiene por objetivo estudiar la composición de las subunidades de la PR. Para ello, los investigadores emplearon diversas técnicas de etiquetado de subunidades y definir la posición de éstas dentro del proteasoma 26S por medio de la técnica de microscopía por crioelectrón (MCE) de partículas individuales. Se trata de un método extremadamente eficiente para estudiar la organización tridimensional del complejo. No obstante, la resolución continúa siendo inadecuada para trazar y asignar completamente las subunidades de la PR. Durante la primera fase del proyecto se llevaron a cabo tres etapas de cromatografía para purificar el proteasoma 26S antes del etiquetado de los anticuerpos. Se etiquetaron correctamente una subunidad de PN y cinco subunidades de PR. En la segunda fase, el proyecto 26S Proteasome se centró en localizar la subunidad Rpn10, para lo que hubo que crear un nuevo método de purificación y etiquetado. El nuevo método aporta los medios para efectuar la purificación por afinidad en una sola etapa y los proteasomas se etiquetan con la ayuda del elemento de interacción específico. Los miembros del proyecto emplearon técnicas bioquímicas para analizar la integridad estructural, la actividad proteolítica y las reacciones de las subunidades de los proteasomas aislados por afinidad y etiquetados; posteriormente, estas técnicas se aplicaron para realizar el análisis de MCE en partículas individuales. De este modo, los investigadores dispusieron de los medios para definir el punto de unión de la proteína enriquecida en núcleos Dsk2 en los complejos de proteasoma 26S y, en última instancia, localizar la subunidad Rpn10.

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