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Subunit localization of the Drosophila 26S proteasome by means of 3D cryo electron microscopy

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La criogenia viene adottata negli studi di biologia strutturale

I complessi proteici di notevoli dimensioni, ad esempio il proteasoma 26S, sono stati ampiamente studiati; i due componenti principali sono la particella nucleosomale e la particella regolatrice.

Salute

Il proteasoma 26S è una massa di molecole di notevoli dimensioni, costituita da circa 35 unità secondarie. Mentre la particella nucleosomale proteolitica è stata oggetto di ampie ricerche, della particella regolatrice si sa ancora poco. Il progetto 26S Proteasome ("Subunit localisation of the Drosophila 26S proteasome by means of 3D cryo electron microscopy"), finanziato dall'UE, è impegnato nello studio della composizione delle unità secondarie delle particelle regolatrici. A tal fine, i ricercatori hanno adottato varie tecniche per etichettare le unità secondarie, definendone l'ubicazione nel proteasoma 26S tramite la criomicroscopia elettronica di singole particelle, un metodo molto potente per studiare l'organizzazione tridimensionale dei complessi; la risoluzione, tuttavia, è ancora insufficiente per poter delineare e designare interamente le unità secondarie delle particelle regolatrici. Durante la prima fase del progetto, sono state utilizzate tre fasi cromatografiche per purificare il proteasoma 26S prima dell'etichettatura degli anticorpi, ed è stato possibile etichettare un'unità secondaria nucleosomale e cinque unità secondarie di particelle regolatrici. Nella seconda fase, il progetto 26S Proteasome si è focalizzato sulla localizzazione dell'unità secondaria Rpn10, per cui si è reso necessario lo sviluppo di un nuovo metodo di purificazione ed etichettatura; con questo particolare metodo, la purificazione delle affinità può essere effettuata in una singola fase e i proteasomi vengono etichettati con l'ausilio del partner di interazione specifico. I membri del progetto hanno fatto uso di tecniche biochimiche per analizzare l'integrità strutturale, l'attività proteolitica e le reazioni delle unità secondarie dei proteasomi etichettati e isolati dalle affinità, che sono stati utilizzati, quindi, per effettuare un'analisi con criomicroscopia elettronica di singole particelle. Questi risultati hanno consentito ai ricercatori di mappare il sito di collegamento della proteina arricchita nucleare Dsk2 nei complessi di proteasomi 26S e di localizzare finalmente l'unità secondaria Rpn10.

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