Simulation der Leber ersetzt Tierversuche
Die Leber baut all die Chemikalien ab, die unser Körper täglich aufnimmt, weshalb sie bei toxikologischen Prüfungen eines der wichtigsten zu untersuchenden Organe darstellt. Doch Wissenschaftler suchen noch immer nach dem perfekten Prüfverfahren. Häufig werden Tierversuche eingesetzt – diese bilden jedoch nicht mit 100 %iger Zuverlässigkeit die Wirkung der geprüften Chemikalien auf die menschliche Leber ab. Das HEMIBIO-Projekt wurde als Teil der Initiative SEURAT-1 ins Leben gerufen, um ein Gerät zur Simulation der komplexen Struktur der menschlichen Leber zu entwickeln und es für vorklinische toxikologische Prüfungen bereitzustellen. Einige Monate vor Abschluss des Projekts entwickelten die Forscher nun erfolgreich ein Instrument, das eine Leber auf einem Chip simuliert („Liver-on-Chip“), metabolisch aktive Leberorganoiden für über einen Monat in-vitro erhalten und toxische Konzentrationen mit einer Genauigkeit von 99 % messen kann. Prof. Catherine Verfaillie, Koordinatorin des Projekts und Direktorin des Stem Cell Institute der KU Leuven, spricht über einige der wichtigsten im Projekt gewonnen Erkenntnisse und die Pläne des Konsortiums für die Zukunft. Wie ist das HEMIBIO-Projekt zustande gekommen? HEMIBIO ist aus der vorausgegangenen Zusammenarbeit vieler der Projektpartner (Dr. Verfaillie, Luttun, van Grunsven, Rogiers, Sancho-Bru, Collas, Nahmias und van Fleteren) entstanden, die zum Ziel hatte, ein In-vitro-Modell der menschlichen Leber zu erstellen. Mit diesem Modell sollten dann Toxizität und virale Hepatitis untersucht sowie Studien durchgeführt werden, die sich auf die kombinierte Kultivierung parenchymaler und non-parenchymaler Leberzellen mithilfe kleiner mikrofluidischer Bioreaktoren richten. Da wir sowohl für die angewandte Wissenschaft als auch für die Grundlagenforschung besonders an der Züchtung von Lebergewebe interessiert waren, betrachteten wir HEMIBIO als Gelegenheit, unsere Zusammenarbeit auf ganz Europa auszuweiten. So wollten wir auch die Entwicklung toxikologischer Prüfverfahren vorantreiben, die Tierversuche ersetzen könnten. Wir warben äußerst kompetente Partner mit Fachkenntnissen zum Aufbau der Leber, Genome Engineering, Sensortechnik und Mikrofabrikation an und erstellten einen Vorschlag, der deutlich mehr als die Summe seiner Teile darstellte. Warum sind Sie der Ansicht, das Tierversuche ersetzt werden müssen? Als der HEMIBIO-Vorschlag eingereicht wurde, wurden bereits mehrere Projekte von der EU finanziert, die zum Ziel hatten, den Bedarf für toxikologische Tierversuche zu senken. Für die Beurteilung der toxischen Effekte bei einer chronischen Belastung mussten jedoch noch sehr häufig Tiere eingesetzt werden, nicht nur für Medikamente und Chemikalien, sondern auch für Kosmetika. Neben den ethischen Beweggründen war ein bedeutender Aspekt, dass für solche Prüfungen in Zukunft geeignete menschliche Zellen verwendet werden sollen, da die Wirkungen auf Tiere nicht immer den tatsächlichen Effekten auf den Menschen entsprechen. Worin bestand Ihr wichtigstes Ziel? Wir waren der Überzeugung, dass zur Entwicklung eines Geräts, das eine Leber für langfristige toxikologische Prüfungen simulieren kann, die zellulären Bestandteile der Leber für längere Zeiträume (von über einem Monat) lebensfähig sein müssen, d. h. eine angemessene Stoffwechsel- und Transportfunktion sowie eine Physiologie aufweisen müssen, die mit der Leber eines Lebewesens vergleichbar sind. Zu diesem Zweck mussten wir den Fluss durch das Gerät, die Zonierung der Hepatocyten (und einiger non-parenchymaler Leberzellen) und die Wirkung der non-parenchymalen auf die Funktion und Downstream-Toxizität der parenchymalen Komponente berücksichtigen – insbesondere wenn es einen der Toxizitätsendpunkte, Leberfibrose und -zirrhose, betraf. Leberfibrose und -zirrhose werden durch ein Zusammenspiel der Hepatocyten-Toxizität und der Aktivierung der hepatischen Sternzellen verursacht, bei der es zu einer Ablagerung von Kollagen und Veränderungen der sinusoiden Endothelialzellen der Leber kommt, die ihre spezifische fenestrierte Membran verlieren. Solche Veränderungen können mit einem Gerät untersucht werden, das die unterschiedlichen Zellkomponenten enthält. Was sind für Sie die wichtigsten Erfolge des Projekts bis heute? HEMIBIO führte bereits zu fünf wichtigen Fortschritten. Erstens entwickelten wir ein „Liver-on-Chip“-Gerät, mit dem metabolisch aktive Leberorganoiden für über einen Monat in-vitro erhalten werden können, indem ihre natürliche Mikroumgebung mit Sauerstoffgradienten imitiert wird. Dies hebt die spezifischen Fortschritte der „Human-on-Chip“-Technologie hervor, da aktuelle Verfahren noch auf einer täglichen Medikamentenverabreichung und Dutzenden Endpunkt-Assays beruhen, die nur wenige kinetische Informationen liefern und von geringem prognostischen Nutzen sind. Ein zweiter Erfolg ist die Erstellung einer breit gefächerten Datensammlung zu sich vermehrenden, metabolisch funktionellen, polarisierten Kulturen primärer menschlicher Hepatocyten – dem Goldstandard für Studien zur Medikamententoxizität. Wir zeigten, dass die TD50 (die toxische Dosis, bei der 50 % der Versuchsorganismen Anzeichen einer Toxizität zeigen) von 12 Verbindungen mithilfe der Zellen mit einer nie dagewesenen Genauigkeit von 99 % vorhergesagt werden konnte, wohingegen HepG2-/C3A-Zellen nur 60 % erreichen. Wir erstellten fünf verschiedene Genotypen von Patienten mit unterschiedlichen ethnischen Hintergründen und ermöglichten so neuartige Untersuchungen zur Variabilität zwischen Patienten und zum Auftreten toxischer Idiosynkrasie in großen Populationen. Ein dritter Erfolg ist die Erstellung eines einzigartigen In-vitro-Modells anhand von Ko-Kulturen von Hepatocyten und Sternzellen zur Untersuchung der Toxizität bei wiederholter Belastung, die letztendlich zu Leberfibrose führt. Der vierte Erfolg besteht in der Entwicklung pluripotenter Stammzellen (hPSC-Master-Zelllinien) durch Genome Engineering, die sich für das RMCE-Kassettenaustauschverfahren (Recombinase-Mediated Cassette Exchange) mit FLPe-Rekombinase im AAVS1-Genlokus eignen. Dies ermöglicht die Erzeugung transgenetischer Zelllinien innerhalb von 3–4 Wochen mit 100 %iger Effizienz und ohne zufällige Integrationen. Mithilfe des RMCE-Verfahrens integrierten wir erfolgreich mehrere Transgene, die zur Zelllinienidentifikation, für toxikologische Zellstudien und zur Gen-Überexpression von Nutzen sein können. Zu guter Letzt definierte HEMIBIO die transkriptionalen, miRNA- und Epigenom-Phänotypen ruhender und aktivierter menschlicher hepatischer Sternzellen neu und führte zu neuartigen Kultivierungssystemen, um menschliche Sternzellen im ruhenden Zustand in-vitro zu erhalten. Wann könnte das Gerät Ihrer Einschätzung nach vermarktet werden? Die Gruppe um Prof. Nahmias von der Hebräischen Universität Jerusalem demonstrierte in Partnerschaft mit dem Fraunhofer-Institut und Upcyte Technologies, dass menschliche Hepatocyten erweitert und ihre Funktion in einem mikrofluidischen Bioreaktor mehr als 28 Tage lang bei kontinuierlicher Sauerstoffmessung erhalten werden können. Diese Liver-on-Chip-Technologie konnte die TD50 von Acetaminophen, Amiodaron, Troglitazon und Rotenon akkurat vorhersagen. Hierbei handelt es sich um eine Reihe von Toxinen von der Gold Compund-Liste aus SEURAT-1, die über ein Bestimmtheitsmaß (R2) von 0,9 bei der In-vitro-In-vivo-Korrelation verfügen. Die Empfindlichkeit des Geräts ermöglichte den Nachweis eines neuen Mechanismus der toxischen Wirkung von Acetaminophen sowie neue Erkenntnisse zur Entwicklung durch Troglitazon verursachter Schäden. Mehrere provisorische Patentanträge wurden für den Bioreaktor, die Verfahren und die Sensoren eingereicht. Einige der Partner ziehen in Erwägung, in den nächsten Monaten ein Unternehmen zu gründen, das Untersuchungsdienste für die Kosmetik- und Pharmaindustrie leisten wird. Darüber hinaus erstellte das Team um Dr. Verfaille eine iPSC-Plattform für Medikamentenprüfungen, welche in naher Zukunft automatisiert werden könnten. So könnten zahlreiche Zelllinien generiert, differenziert und für Hochdurchsatzprüfungen angewendet werden. Ist es realistisch, dass Tierversuche so in naher Zukunft ersetzt werden könnten? Wir sind überzeugt, dass der in HEMIBIO erreichte Fortschritt dazu beitragen wird, Tierversuche durch In-vitro-Prüfungen zu ersetzen. Allerdings werden noch zahlreiche Studien zur In-vitro-In-vivo-Korrelation erforderlich sein, um Tierversuche vollständig durch In-vitro-Prüfungen mit menschlichen Zellen in Bioreaktoren zu ersetzen. Was möchten Sie bis zum Ende des Projekts noch erreichen, und was werden Sie anschließend unternehmen? Mehrere Partner des HEMIBIO-Konsortiums (und anderer SEURAT-1-Projekte) sind an lokalen Nachfolgeprogrammen (van Grunsven, van de Water, Verfaillie) und an weiterführenden EU-H2020-Projekten (Verfaillie, van de Water) beteiligt oder arbeiten direkt mit Kosmetikunternehmen zusammen (Nahmias), um an der Erstellung toxikologischer In-vitro-Lebermodelle weiterzuforschen. Mit diesen Modellen werden Tierversuche schließlich durch In-vitro-Untersuchungen mit menschlichen Zellen ersetzt werden können, bei denen künstliche Leberorganoiden in mikrofluidischen Bioreaktoren zum Einsatz kommen. Die im Rahmen des HEMIBIO-Projekts erreichten Fortschritte werden in diesen Unternehmungen weitergeführt werden.
Länder
Belgien