Enzymmutationen für schnellere industrielle Prozesse
Das EU-finanzierte Projekt "Xylanases as models for understanding enzymatic catalysis" (XYLANASES) studierte an gängigen Enzymen die Rolle von entfernten Rückständen in der Katalyse. Xylanasen sind Glycosidasen, die von Pilzen, Bakterien und Hefe gebildet werden, und bauen Hemicellulose, einen Hauptbestandteil der pflanzlichen Zellwände, ab. In der Papierindustrie werden sie kommerziell weit verbreitet eingesetzt. Die Projektmitglieder wollten verstehen, wie entfernte Teile eines Enzyms zur Katalyse beitragen. Xylanasen gehören zu den besten mechanistisch und strukturell charakterisierten Enzymen und stellen daher ideale Modellsysteme für solche Forschung dar. Die Wissenschaftler untersuchten die Beteiligung von spezifischen Aminosäuren an der Katalyse durch Verwendung einer Kombination aus Mutagenese, Proteinsynthese, Enzymkinetik, Proteinkernspinresonanz (NMR) und Röntgenstrahl-Kristallographie. Systematisch induzierte Mutationen führten zu Veränderungen bei Enzymstruktur und -aktivität. Entfernte Aminosäuremutationen in der Xylanase von Bacillus circulans resultierten in wesentlich veränderten Expressions- und Reinigungseigenschaften. Mittels Proteinsemisynthese wurden unnatürliche Aminosäuren eingeführt. Nach kinetischen Untersuchungen der Mutanten folgte die Strukturanalyse mit NMR. In Röntgenuntersuchungen wurden die 3D-Strukturen der ausgewählten Mutanten ermittelt. So war es möglich, die Inaktivierung und Reaktivierung der Mutanten in Echtzeit zu verfolgen. XYLANASES zeigte zum ersten Mal in vivo eine ortsspezifische unnatürliche Aminosäure Mutagenese an einem kohlenhydrataktiven Enzym. Die Aktivität der Mutanten wurde im Vergleich zum Wildtyp-Enzym 8-55 mal verändert. Mutationen mit Einfluss auf die Enzym-Inaktivierung und -Reaktivierung waren voneinander verschieden. Strukturuntersuchungen mittels Röntgenkristallographie sollen Einblicke in die Modulation der Inaktivierung liefern. Das Projekt schuf robuste Proteinexpressionsbedingungen, die genügend Proteine umfassende unnatürliche Aminosäuren für röntgenkristallographische Studien ergaben. Obwohl Xylanasen aus Bacillus circulans zuvor kristallisiert wurden, wurden keine Kristallproteine mit unnatürlichen Aminosäuren hergestellt. Man geht davon aus, dass die Daten aus der Kristallographie helfen werden, die kinetischen Effekte des Einbaus von nichtnatürlichen Aminosäuren in Schlüsselpositionen von Xylanasen zu klären.
Schlüsselbegriffe
Enzyme, Enzymmutationen, Xylanasen, Enzymkatalyse, Bacillus circulans
