Microscopia a cellule vive con livelli di ossigeno preimpostati
Durante la respirazione l’ossigeno atmosferico viene inalato e successivamente trasportato attraverso il sangue al corpo, in modo da agevolare la produzione di energia. I livelli standard di ossigeno presente nei tessuti sono compresi tra il 4 e il 9 %, risultando quindi molto inferiori rispetto a quelli atmosferici (pari al 21 %). Livelli di ossigeno superiori (iperossia) o inferiori (ipossia) alla soglia normale possono essere dannosi per le cellule e i tessuti. Questo rischio è esemplificato dall’ischemia, una condizione che può comportare l’infarto miocardico o determinare l’acidificazione muscolare nel corso dell’esercizio fisico. A causa di una scarsa vascolarizzazione, anche i tumori solidi di grandi dimensioni sono solitamente ipossici, il che ostacola fortemente il raggiungimento di esiti positivi nei trattamenti.
Una nuova camera di microscopia per regolare i livelli di ossigeno
I saggi cellulari sono usati di routine nei processi di scoperta dei farmaci, procedure essenziali per rispondere alle crescenti esigenze sanitarie della nostra società. La maggior parte di questi studi viene svolta impiegando metodi di microscopia a cellule vive che si avvalgono di potenti tinture fluorescenti di segnalazione in grado di mostrare singoli segnali nelle cellule viventi in tempo reale e ad alta risoluzione. Ciononostante, tali studi sono effettuati in condizioni di ossigeno ambientali, che sono considerate iperossiche per le cellule. Intrapreso con il sostegno del programma di azioni Marie Skłodowska-Curie(si apre in una nuova finestra) (MSCA), il progetto MICROX ha proposto lo sviluppo di una camera di microscopia ermetica intesa a permettere ai ricercatori di lavorare con livelli di ossigeno fissati arbitrariamente. «Il nostro obiettivo era quello di riprodurre le condizioni in vivo delle cellule e dei tessuti rendendo i saggi cellullari più rilevanti e capaci di offrire una maggiore precisione», spiega Kees Jalink(si apre in una nuova finestra), il coordinatore del progetto. Il compito di ottenere condizioni realmente ipossiche al microscopio garantendo al contempo un buon accesso alle cellule, prerequisito necessario per integrare ormoni e farmaci al fine di studiare i meccanismi di segnalazione, si è rilevato piuttosto impegnativo. La camera di microscopia proposta è stata sviluppata e implementata con successo per effettuare sperimentazioni di routine con diversi livelli di ossigeno. Utilizzando questa configurazione è possibile modificare le condizioni dei gas (ovvero ossigeno, azoto e anidride carbonica) in pochi minuti, ottenendo ipossia assoluta dimostrata da livelli di ossigeno affidabili, al di sotto dello 0,5 %. La progettazione di MICROX registra prestazioni nettamente migliori rispetto alle soluzioni commerciali disponibili.
Segnalazione cellulare con vari livelli di ossigeno
I ricercatori hanno inoltre convalidato la funzionalità dei sensori fluorescenti disponibili in condizioni di ipossia per poi approfondire l’impatto esercitato da diversi livelli di ossigeno su fenomeni di segnalazione cellulare chiave. Il lavoro si è incentrato sul nucleotide noto come adenosina monofosfato ciclico(si apre in una nuova finestra) (cAMP, adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate), che funge da fondamentale secondo messaggero in numerosi percorsi di trasduzione del segnale convertendo i segnali extracellulari ricevuti dai recettori della superficie cellulare in segnali intracellulari. Questa molecola, caratterizzata da un ciclo di vita rapido, è responsabile della regolazione di varie funzioni cellulari, tra cui la crescita e la differenziazione, la trascrizione genica e l’espressione proteica.( Secondo la borsista MSCA Olga Kukk: «Sebbene l’ipossia a lungo termine attivi il fattore 1 inducibile dall’ipossia e moduli la trascrizione genica, in base alla nostra ipotesi un effetto immediato (compreso tra pochi secondi e qualche ora) dell’ipossia sulla segnalazione cellulare sarebbe indipendente dalla trascrizione stessa.» È interessante notare che i ricercatori non sono stati in grado di verificare questa ipotesi in vari sistemi di segnalazione rapida da loro analizzati, non avendo osservato alterazioni visibili dei segnali.
La promessa della microscopia di MICROX per la scoperta dei farmaci
La progettazione di microscopia concepita da MICROX offre capacità di regolazione completa delle condizioni atmosferiche, che rappresenta un importante passo in avanti verso l’istituzione di saggi sulla fisiologia cellulare per lo screening dei composti biologicamente attivi. Inoltre, si prevede che contribuirà agli approfondimenti di ricerca con oggetto gli eventi dinamici nelle cellule viventi, che richiedono una risoluzione spaziale e temporale particolarmente dettagliata.
