Descripción del proyecto
Visualización de la replicación del ADN dependiente del origen en sustratos originales
Los errores en los mecanismos que controlan la replicación del ADN pueden provocar inestabilidad genómica y conducir al desarrollo de enfermedades genéticas y cáncer. Los estudios estructurales se han centrado en complejos de replicación aislados utilizando sustratos de ADN simplificados para la obtención de imágenes de la estructura de los replisomas y el desenrollamiento del ADN. Financiado por las Acciones Marie Skłodowska-Curie, el proyecto DNA-Rep-EM integrará la microscopía crioelectrónica de partícula única en métodos bioquímicos para obtener imágenes de las reacciones de replicación del ADN dependiente del origen «in vitro» en sustratos de ADN originales. Los investigadores desarrollarán sustratos cortos de ADN que contengan el origen para la carga de una horquilla de replicación bidireccional única y la visualización de grandes números de orígenes vinculados a proteínas en un único campo de visión.
Objetivo
Genome duplication is essential for cell proliferation. Errors in the mechanisms that control DNA replication can cause genomic instability and lead to the development of genetic diseases and cancer. In vitro reconstitution of DNA replication with purified yeast proteins has helped uncover important mechanisms of DNA replication. How changes in protein structure regulates function during key events in origin activation and replisome progression, such as melting of the DNA duplex upon CMG helicase assembly, or the mode of binding of Pol alpha during primer synthesis remain unknown. To date, structural studies have focused on imaging artificially isolated replication complexes using simplified DNA substrates to understand DNA unwinding and replisome architecture. To truly understand the mechanisms that control DNA replication, future structural studies must not only visualise isolated complexes, but also reconstituted reactions. To address this issue, I will integrate single-particle cryo electron-microscopy (cryo-EM) with sophisticated biochemical approaches to image origin-dependent DNA replication reactions in vitro on native DNA substrates. To do so, I will establish short origin-containing DNA substrates that permit loading of a single bidirectional replication fork, allowing large numbers of protein bound origins to be visualised within a single field of view. Initially, I will investigate how the structure of duplex DNA changes upon CMG formation during origin activation. Next, I will examine the molecular mechanisms of primer synthesis after origin activation using both cryo-EM and in vitro DNA replication reactions. Finally, I will capture and image synthesising intact replisomes at near atomic resolution. By visualising entire DNA replication reactions instead of isolated replication complexes at high resolution, we will gain a deeper understanding of the molecular mechanisms that permit the eukaryotic replisome to function during genome duplication.
Ámbito científico (EuroSciVoc)
CORDIS clasifica los proyectos con EuroSciVoc, una taxonomía plurilingüe de ámbitos científicos, mediante un proceso semiautomático basado en técnicas de procesamiento del lenguaje natural.
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Palabras clave
Programa(s)
Régimen de financiación
MSCA-IF - Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowships (IF)Coordinador
NW1 1AT London
Reino Unido