Optical nanoscopy at 1 nm resolution: far-field fluorescence control at cryogenic temperatures

Projektbeschreibung

Noch nie dagewesene Ein-Nanometer-Auflösung revolutioniert die Lichtmikroskopie in der Nanodimension

Seit der Erfindung des ersten optischen Mikroskops im späten 16. Jahrhundert haben Technologien, die sich die Wechselwirkung zwischen Licht und Materie zunutze machen, einen immer detaillierteren Blick auf die Struktur und Funktion von lebenden und nicht lebenden Materialien ermöglicht. Die Lichtmikroskopie in der Nanodimension, die 2014 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde, weil sie die vermeintliche wissenschaftliche optische Auflösungsgrenze überschritten hat, ist heute ein Werkzeugkasten von Verfahren, mit denen Objekte im Nanometerbereich in ihrer natürlichen Umgebung beobachtet werden können. Das vom Europäischen Forschungsrat finanzierte Projekt OptnanoATcryo wird die nächste Evolutionsstufe mit einer signifikanten Erhöhung der Markierungsdichte und der Anzahl der gesammelten Photonen von einzelnen fluoreszierenden Emittern einleiten. Mithilfe der Fluoreszenzkontrolle bei kryogenen Temperaturen und neuartiger Superauflösungs-Rekonstruktionsverfahren wird dieses Verfahren eine noch nie dagewesene 3D-Auflösung von einem Nanometer bieten.

Ziel

Optical nanoscopy is a powerful technique used in biology to study subcellular structures and function via specifically targeted fluorescent labels. Localization microscopy in particular offers a much better resolution (~10-50 nm) than conventional microscopy (~250 nm) while being relatively undemanding on the experimental setup and the subsequent image analysis. The next revolution in imaging to 1 nm isotropic resolution in 3D must realize a big increase in the number of collected photons from single fluorescent emitters as well as in the labelling density. Only then can subcellular structures be imaged at the molecular level to study the molecular machinery of the cell. Notably observations of DNA conformation in 3D at such resolutions would be spectacular and enable investigation of biophysical models ranging from chromosomal DNA packaging to gene regulation.

I propose a new imaging technique based on fluorescence control at cryogenic temperatures in combination with novel data driven super-resolution reconstruction schemes employing prior knowledge that promises this unprecedented optical far-field resolution. I introduce a twofold technical leap by i) much higher photon counts due to negligible photobleaching at cryogenic temperatures while maintaining the sparsity required for single emitter localization and ii) relaxing the required labelling density using a priori information and the averaging of many identical entities. Orientational blinking ensures single emitter localization via a combination of polarization sensitive excitation, detection and stimulated depletion and triplet state shelving.
Biophysical models of cell structures and data driven priors mean that fewer samples are needed to fully describe a structure.
In a larger perspective, the outcome of this research will enable the combination of structural cryo-electron microscopy imaging at subnanometer resolutions with functional fluorescent imaging at the nanometer scale.