Towards nanopore proteomics: enhancing cytolysin performance through genetically encoded noncanonical amino acids

Projektbeschreibung

Nanoporen-Technologie wird tragbare und schnelle Sensorik seltener Proteine ermöglichen

Die Nanoporen-Technologie beruht auf natürlich vorkommenden Proteinporen, die auf rekonstituierten Lipidoberflächen zusammengefügt werden können. Unter angelegter Spannung bewegen sich geladene Makromoleküle durch die Poren und verändern den Ionenfluss. Veränderungen des Ionenstroms sind für die durchgeführten Moleküle charakteristisch und wurden mit großem Erfolg auf die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung angewandt. Das EU-finanzierte Projekt nanoEx verbessert die Technologie zur Proteinerkennung durch eine rationale Modifizierung der Nanoporen durch die gesteuerte Entwicklung und Einführung nicht-kanonischer Aminosäuren mit anschließender biophysischer und struktureller Charakterisierung dieser Nanoporen. Eine verbesserte Nanoporen-Biosensorik für die Proteinsequenzierung wird auf dem Gebiet der medizinischen und ökologischen Diagnose- und Überwachungsanwendungen einen bedeutenden Einfluss auf die Proteinerkennung in Echtzeit haben.

Ziel

Accurate detection of low-abundance proteins in biological samples obtained from patients or invasive species relies on appropriate handling and fixation techniques. Due to their inherent instability and propensity to denature upon freeze-thaw treatments, important protein markers tend to escape detection. Analogous challenges in RNA sequencing have been mitigated by the use of nanopore technology. European academic research and industry actions led to the creation of the widely used MinION devices that employ nanopore technology to enable DNA and RNA sequencing to be executed on site. Through this application I seek to improve nanopores as biosensors for the detection of proteins that will facilitate immediate protein analysis from clinical or ecological samples. I will use my expertise in genetic code expansion (GCE) techniques to engineer two well-characterized cytolysins with distinct architectures: an α-helical actinoporin and β-barrel containing lysenin. To improve these pores for protein identification and sequencing, the proposed research will advance through four stages: Incorporation of noncanonical amino acid (ncAA) to covalently stabilize smaller pores (1) and modulate the pore’s sensing region (2), directed evolution of residues lining the channel walls (3) and structural characterization of the identified variants (4). This is a multidisciplinary project that combines GCE techniques with advanced biophysical and structural characterization of the evolved nanopores. The host’s expertise in nanopore analysis together with my experience with GCE and directed evolution methods provide an important two-way transfer of knowledge. Action includes a training-through-research essential to advance my future academic career and enhance my employability in the biomedical industry. I anticipate the results of nanoEx project will have a major impact on the progress of nanopore biosensing, increasing the competitiveness of the European industry in protein sequencing.