Elektronenmikroskopie für die Proteinstrukturanalyse
Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist eine Transmissions-Elektronen-Mikroskopie-Technik, die fast atomare Auflösungsinformationen für große und hochsymmetrische Protein-Komplexe liefert. Im Gegensatz zu Röntgenkristallographie, untersucht Kryo-EM diese Komplexe in ihrer physiologischen Umgebung, ohne die potentiellen Artefakte, die während des Kristallisationsprozesses erzeugt werden. Jedoch ist die Anwendung von Kryo-EM auf kleine Proteine problematisch, vor allem wegen des schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses, welches die Partikelselektion und Orientierungsbestimmung behindern. Um dieses Problem zu lösen hat das EU-finanzierte Projekt EM-FRAME (DNA-origami scaffolds for structure determination by single particle analysis) vorgeschlagen Proteine zu großen 3D-Gerüsten zu binden, die aus DNA-Origami bestehen. DNA-Origami ist ein Begriff, der für hohle Rechteckrahmen verwendet wird, die eine DNA-Doppelhelix auf der Innenseite enthalten, an die DNA-bindende Proteine anhaften können. Durch Nutzung des spiralförmigen Charakters der DNA, ist es möglich, die Orientierung des gebundenen Proteins zu wenden und experimentelle Hinweise auf seine Konformation zu erhalten. Um eine bessere Partikelauswahl zu erhalten, erzeugten die Forscher neue Detektoren, die Bilder mit einem besseren Kontrast liefern und die Partikelauswahl sehr erleichtern. Sie verbesserten die Auflösung weiter durch Entwicklung eines Bildverarbeitungsverfahrens, das Filme von den neuen Detektoren verwendet, um Probenbewegungen zu korrigieren. Die Gesamtleistung des optimierten Verfahrens wurde durch Lösung der fast-atomaren Auflösung für die mitochondrialen Ribosomen aus Hefe und Mensch und der cytoplasmatischen Ribosomen von P. falciparum validiert. Routinemäßige Durchführung des Verfahrens sollte dazu beitragen, die Konformation und die Funktion einer Anzahl von Proteinen menschlichen Ursprungs zu lösen.
Schlüsselbegriffe
Protein, Struktur, Kryo-Elektronenmikroskopie, Auflösung, DNA-Origami
