La microscopia elettronica per l’analisi strutturale delle proteine
La microscopia crioelettronica (cryo-EM) è una tecnica di microscopia elettronica a trasmissione che offre informazioni a risoluzione quasi atomica per complessi proteici grandi e ad alta simmetria. Contrariamente alla cristallografia a raggi X la cryo-EM studia questi complessi nel loro ambiente fisiologico senza i potenziali artefatti generati durante il processo di cristallizzazione. Ma l’applicazione della cryo-EM alle piccole proteine è problematica soprattutto per i cattivi rapporti segnale/rumore che ostacolano la selezione delle particelle e la determinazione dell’orientamento. Per ovviare a ciò il progetto EM-FRAME (DNA-origami scaffolds for structure determination by single particle analysis), finanziato dall’UE, ha proposto di legare le proteine a grandi scaffold tridimensionali composti da origami di DNA. Con origami di DNA si indicano strutture rettangolari cave che contengono all’interno una doppia elica di DNA per permettere alle proteine che legano il DNA di aderirvi. Sfruttando il carattere elicoidale del DNA è possibile ruotare l’orientamento della proteina legata e ottenere informazioni sperimentali sulla sua conformazione. Per ottenere una migliore selezione delle particelle i ricercatori hanno generato nuovi rilevatori che fornivano immagini con un migliore contrasto e facilitavano fortemente la selezione delle particelle. Hanno migliorato ulteriormente la risoluzione sviluppando una procedura di elaborazione delle immagini che utilizza filmati dai nuovi rilevatori per correggere i moti campione. La performance generale del metodo ottimizzato è stata convalidata risolvendo (strutture di cryo-EM) a risoluzione quasi atomica per il ribosoma mitocondriale di lievito e umano e il ribosoma citoplasmatico di P. falciparum. L’implementazione di routine del metodo dovrebbe aiutare a risolvere la conformazione e la funzione di una serie di proteine di origine umana.
Parole chiave
Proteina, struttura, microscopia crioelettronica, risoluzione, origami di DNA
