Proteínas plegadas antes de su transporte
La secreción de proteínas a través de la membrana citoplasmática es una función esencial de todas las células. Las proteínas desplegadas son transportadas por la ruta Sec, una vía de secreción proteica muy bien caracterizada. Sin embargo, la secreción de proteínas plegadas a través de la compleja ruta de translocación de argininas gemelas (Tat) es mucho menos conocida. El proyecto SMTAT (Single-molecule imaging of twin-arginine transporter assembly) empleó una nueva bicapa lipídica artificial desarrollada previamente por sus investigadores para estudiar la ruta Tat. Esta membrana no solo presenta una estabilidad excepcional y permite una reconstitución simple de proteínas de membrana, sino que además constituye un modelo idóneo para obtener imágenes de fluorescencia de molécula única y registros eléctricos de canal único a través de un sello de alta resistencia (del orden del gigaohm). La unión de múltiples copias de los tres tipos principales de proteínas de membrana que constituyen la ruta Tat (TatA, TatB y TatC) para formar un complejo multiproteico receptor y una translocasa permite el transporte de sustratos de diferentes tamaños. El equipo de SMTAT evaluó la concentración relativa de las tres proteínas en el complejo multiproteico. El novedoso protocolo desarrollado por el equipo de SMTAT para medir la estequiometría de las proteínas individuales podría además emplearse en el futuro como base para cuantificar otras proteínas de membrana. Este método empleaba la fluorescencia de molécula única y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para detectar un fluoróforo químico en una concentración subestequiométrica que, previamente, había sido fotoblanqueado de manera precisa para permitir el fotoblanqueo por etapas del mismo. Para crear un sistema bicapa in vitro con las proteínas Tat reconstituidas, el equipo incorporó las tres proteínas Tat en sistemas bicapa de microemulsiones agua-aceite. En este contexto, se observó que las proteínas se difundían libremente y, por tanto, se evaluaron sus constantes de difusión lateral. Gracias a la colaboración con otros grupos de investigación, el equipo de SMTAT logró estudiar a nivel molecular las interacciones entre las proteínas Tat. El trabajo permitió desarrollar un modelo estructural para el ensamblaje de la translocasa Tat activa y confirmar que técnicas como la fluorescencia de molécula única y el análisis de coevolución, basado en el alineamiento múltiple de secuencias, pueden usarse para predecir interfaces proteicas en complejos multi-subunidad. Los resultados del proyecto SMTAT han sentado las bases para investigar el transporte de proteínas a través de la membrana citoplásmica y sus aplicaciones potenciales incluyen el diseño de fármacos y el estudio de la progresión de diferentes enfermedades. Además, los descubrimientos han sido publicados en las revistas científicas de gran prestigio internacional como eLife y Molecular Microbiology.
Palabras clave
Proteína, transporte, membrana citoplasmática, ruta Tat, SMTAT