Białka zwijane przed transportem Naukowcy z UE zbadali złożony sposób przemieszczania białek przez błonę cytoplazmatyczną. Badania podstawowe Zdrowie © Kateryna Kon, Shutterstock Eksportowanie białek przez błonę cytoplazmatyczną to kluczowa funkcja wszystkich komórek. W przypadku białek rozwiniętych istnieje dobrze zbadany szlak Sec. Jednak wiedza na temat szlaku złożonej translokacji podwójnej argininy (Tat) obejmującego zwinięte białka jest zdecydowanie mniejsza. W projekcie SMTAT (Single-molecule imaging of twin-arginine transporter assembly) użyto nowo opracowanej sztucznej podwójnej warstwy lipidowej w celu zbadania szlaku Tat. Dzięki wyjątkowej stabilności i możliwości prostej syntezy białek błony, ta błona modelowa umożliwia obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek oraz jednokanałowe rejestrowanie elektryczne za pośrednictwem uszczelnień o rezystancji 1 gigaohma. Zespół wielu kopii trzech głównych białek – TatA, TatB i TatC – tworzących kompleks receptora i translokazę umożliwia transport substratów różnej wielkości. Zespół projektu SMTAT zbadał względne ilości tych trzech białek w kompleksie. Podejście zastosowane w projekcie SMTAT do pomiaru stechiometrii poszczególnych białek jest pierwszym tego typu podejściem i może być wykorzystywane jako podstawa do pomiaru innych białek błony. Metoda ta polega na zastosowaniu badań fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek oraz badań mikroskopowych opartych na łącznym wewnętrznym załamaniu światła fluorescencyjnego (TIRF, total internal reflection fluorescence). Fluorofor chemiczny w stężeniu substechiometrycznym został starannie wybielony światłem w celu umożliwienia stopniowego przeprowadzenia tego procesu. Aby utworzyć dwuwarstwowy system in vitro przy użyciu zsyntetyzowanych białek Tat, zespół wykorzystał wszystkie trzy dwuwarstwowe systemy w postaci kropel. Stałe dyfuzji bocznej tych systemów zostały zarejestrowane po zakończeniu ich obserwacji w warunkach swobodnej dyfuzji. We współpracy z innymi laboratoriami w ramach projektu SMTAT zbadano interakcje między białkami Tat na poziomie cząsteczkowym. Wynikiem prac był model strukturalny tworzenia się aktywnej translokazy Tat oraz potwierdzenie, że techniki, takie jak fluorescencja cząsteczek i analiza współewolucji w oparciu o wiele dopasowań sekwencji przy użyciu znaków sekwencji, mogą być używane do przewidywania warstw międzybiałkowych w kompleksach o wielu podjednostkach. Wyniki badań projektu SMTAT stworzyły podstawę do badań przemieszczania białek przez błonę cytoplazmatyczną, których zastosowania mogą obejmować projektowanie leków i badanie postępu wielu chorób. Praca została opublikowana w czasopismach eLife i Molecular Microbiology. Słowa kluczowe Białko, transport, błona cytoplazmatyczna, szlak białka Tat, SMTAT
