Proteine ripiegate prima del trasporto
L’esportazione di proteine attraverso la membrana citoplasmatica costituisce una funzione essenziale di tutte le cellule. Per le proteine non ripiegate, esiste la via di Sec, ampiamente studiata. Invece, si comprende molto meno la complessa via di traslocazione con arginine gemelle (Tat) che riguarda le proteine ripiegate. Il progetto SMTAT (Single-molecule imaging of twin-arginine transporter assembly) si è servito del suo doppio strato lipidico artificiale appena sviluppato per studiare la via di Tat. Il modello di membrana, dotato di eccezionale stabilità ed è anche una semplice ricostituzione delle proteine della membrana, consente di acquisire immagini a fluorescenza a singola molecola e la registrazione elettrica monocanale tramite contatti di gigaohm. L’assemblaggio di più copie delle tre principali proteine (TatA, TatB e TatC) diretto a formare un complesso recettore e una translocasi consente il trasporto di sostrati di dimensioni variabili. Il team MTAT ha valutato le quantità relative delle tre proteine presenti nel complesso. Il protocollo SMTAT, concepito per misurare la stechiometria delle singole proteine, è un primo passo e potrebbe servire da base per misurare altre proteine della membrana. Il metodo ha utilizzato la microscopia a fluorescenza a singola molecola e a riflessione totale interna in fluorescenza (TIRF). Il fluoroforo chimico a concentrazione substechiometrica è stato attentamente sottoposto a fotobleaching (riduzione della fluorescenza per degradazione chimica), in modo da permettere a tale processo di procedere gradualmente. Per assemblare un sistema a doppio strato in vitro con le proteine Tat ricostituite, il team ha integrato tutte e tre in sistemi a doppio strato a interfaccia di goccia. Le relative costanti di diffusione laterale sono state registrate, dopo la loro osservazione in diffusione libera. In collaborazione con altri laboratori, SMTAT ha studiato le interazioni tra le proteine Tat a livello molecolare. Dal lavoro è scaturito un modello strutturale per l’assemblaggio della translocasi Tat attiva, accanto alla conferma che è possibile utilizzare tecniche come la fluorescenza di molecole e l’analisi di coevoluzione, basata su più allineamenti di sequenza per caratteri di sequenza, per predire le interfacce delle proteine in complessi multi-subunità. I risultati della ricerca SMTAT hanno posto le basi per lo studio dello spostamento delle proteine attraverso la membrana citoplasmatica; tra le applicazioni potrebbero figurare la formulazione di farmaci e lo studio della progressione di molte malattie. Il lavoro è stato pubblicato su eLife e Molecular Microbiology.
Parole chiave
Proteina, trasporto, membrana citoplasmatica, via di Tat, SMTAT