Proteinfaltung vor dem Transport
Der Export von Proteinen durch eine Zytoplasmamembran ist eine wesentliche Funktion aller Zellen. Für ungefaltete Proteine gibt es den gut untersuchten Sec-Pfad. Jedoch ist der komplexe Tat-Stoffwechselweg (twin arginine translocation, Tat), an dem gefaltete Proteine beteiligt sind, weit weniger gut verstanden. Das Projekt SMTAT (Single-molecule imaging of twin-arginine transporter assembly) verwendete eine neu entwickelte künstliche Lipiddoppelschicht, um den Tat-Pfad zu studieren. Angesichts einer hohen Stabilität sowie einfachen Rekonstitution von Membranproteinen ermöglicht die Modellmembran Einzelmolekülfluoreszenzbildgebung und einkanalige elektrische Aufnahme über Gigaohm-Dichtungen. Die Montage von mehreren Kopien der drei Hauptproteine - TatA, TatB und TatC - um einen Rezeptorkomplex und eine Translokase zu bilden, ermöglichte den Transport von Substraten unterschiedlicher Größen. Das SMTAT-Team bewertete die relativen Mengen der drei Proteine in dem Komplex. Das SMTAT-Protokoll, das die Stöchiometrie der einzelnen Proteine messen soll, ist eine Neuheit und könnte als Basis für die Messung anderer Membranproteine verwendet werden. Das Verfahren verwendete Einzelmolekül-Fluoreszenz- und Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). Das chemische Fluorophor wurde bei einer substoichometrischen Konzentration sorgfältig fotogebleicht, damit dieser Prozess schrittweise vorangehen kann. Um ein in-vitro-Bilayer-System mit den rekonstituierten Tat-Proteinen zusammenzubauen, arbeitete das Team alle drei in Tröpfchen-Bilayer-Schnittstellensysteme ein. Ihre lateralen Diffusionskonstanten wurden aufgezeichnet, nachdem beobachtet wurde, dass sie frei diffundierend sind. SMTAT untersuchte in Zusammenarbeit mit anderen Labors die Wechselwirkungen zwischen Tat-Proteinen auf molekularer Ebene. Die Arbeit hat zu einem Strukturmodell für die Zusammensetzung der aktiven Tat-Translokase geführt und bestätigt, dass Techniken wie Molekül-Fluoreszenz und Co-Evolutionsanalyse, basierend auf multiplen Sequenz-Alignments durch Sequenz-Zeichen, verwendet werden können, um Protein-Schnittstellen in Multi-Subunit-Komplexen vorherzusagen . Die Forschungsergebnisse von SMTAT haben die Grundlagen für das Studium der Bewegung von Proteinen durch die Zytoplasmamembran gelegt und die Anwendungen würden die Entwicklung von Arzneimitteln und das Studium der Progression von vielen Krankheiten umfassen. Die Arbeit wurde in den Zeitschriften eLife und Molecular Mikrobiology veröffentlicht.
Schlüsselbegriffe
Protein, Transport, Zytoplasmamembran, Tat-Weg, SMTAT