La riprogrammazione delle cellule staminali
Le cellule staminali pluripotenti possono dividersi indefinitamente e differenziarsi in qualsiasi cellula somatica del nostro corpo. La scoperta della riprogrammazione cellulare diretta e della tecnologia cellulare basata su cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) lascia intravedere la possibilità di ottenere sistemi di gene delivery non virali, basati su trasposone. I geni necessari per la riprogrammazione, tuttavia, sono integrati in modo permanente nel genoma delle cellule ospiti e questo può danneggiare le funzioni dei geni endogeni o persino comportare il rischio di sviluppare tumori. Il progetto INDUSTEM ("Comparative stem cell research in mouse and humans"), finanziato dall'UE, ha testato un nuovo metodo di riprogrammazione basato sul trasposone sleeping beauty (SB), uno strumento di manipolazione genetica delle cellule dei mammiferi che si avvale di elementi del DNA che entrano ed escono dal genoma tramite espressione delle trasposasi. La riprogrammazione cellulare iPS è stata ottenuta mediante trasposizione di cassette di espressione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (OSKM) e OSKM + Lin28 (OSKML) mobilizzate tramite la trasposasi iperattiva SB100X. Come fonte di riprogrammazione sono stati utilizzati fibroblasti embrionali di ratto e fibroblasti fetali. L'efficienza della derivazione cellulare iPS con il sistema basato su trasposone SB ha mostrato valori confrontabili con quelli ottenuti con i vettori retrovirali. La coespressione del cluster miRNA302/367 con OSKM ha migliorato in modo significativo l'efficienza della riprogrammazione, accelerandone la cinetica. Le cellule iPS hanno mostrato un cariotipo stabile, espressione dei marcatori delle cellule staminali, e la capacità di differenziarsi in corpi embrioidi in vitro. La ricerca ha mostrato lo scambio mediato da ricombinasi Cre, che permette la rimozione simultanea della cassetta di riprogrammazione e il knock-in mirato della cassetta di espressione desiderata nel locus taggato con trasposone nelle cellule iPS dei ratti. Questa strategia permetterà di correggere i difetti genetici tramite inserimento nel sito specifico di un costrutto genetico terapeutico nei siti "sicuri" dei genomi di cellule iPS autologhe derivate dal paziente. I risultati del progetto sono stati presentati in numerose pubblicazioni. Il lavoro del progetto INDUSTEM ha inoltre perfezionato e migliorato i protocolli di differenziazione efficiente per la produzione di cardiomiociti che, cosa ancor più importante, sono ora basati su reagenti di coltura definiti e privi di prodotti animali, un prerequisito importante per le future applicazioni cliniche.
