Protein-Interaktion in Echtzeit
Proteine sind wichtige Akteure in den meisten zellulären Prozessen und oft vermitteln sie ihre Funktionen durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen. In dieser Hinsicht sind Methoden zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb von Zellen sehr wünschenswert. Um dieses Ziel zu erreichen, schlug die EU-finanzierte Initiative KINASE CROSSLINKING (Capturing kinase-substrate pairs in intact mammalian cells by using unnatural amino acid mutagenesis and photocrosslinking) die Einführung von Photon-aktivierten Aminosäuren in Proteine vor, um ihre Wechselwirkung mit anderen Molekülen zu untersuchen. Nach einer UV-Bestrahlung können diese Aminosäuren das Protein mit seinem Substrat vernetzen. Die Forscher interessierten sich besonders für Kinasen, also für die Enzyme, die Proteine phosphorylieren und eine entscheidende Rolle bei Übertragungswegen spielen. In einem ersten Schritt entwickelten sie ein neuartiges vielseitiges Expressionssystem, das die rekombinante Herstellung von Proteinen ermöglicht, die mit Photon-aktivierten Derivaten von Tyrosin genetisch modifiziert wurden. Zur Erhaltung der Proteinstruktur screenten die Wissenschaftler verschiedene Stellen in der gesamten Proteinkinase, sowohl in der katalytischen Tasche als auch in deren Nähe, auf ihre Eignung zur Aufnahme des Vernetzers hin. Als Proof of Principle untersuchten sie die Wechselwirkung zwischen dem Klasse B G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Corticotropin-Releasing-Faktor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R) und seinem Peptid-Ligand Urocortin-I (Ucn1). Die Einführung der photoaktivierten Aminosäure in CRF1R führte zur Aufklärung der molekularen Determinanten, die für die Liganden-vermittelte GPCR-Aktivierung verantwortlich sind. Durch Veränderung der Position der Photos-Aktivierten Aminosäuren erhielten die Forscher eine Panoramakarte der Peptidbindungstasche sowie strukturelle Einblicke zum Rezeptor selbst. In Anbetracht der Tatsache, dass GPCR wichtige pharmakologische Ziele darstellen, werden die generierten Informationen helfen, die GPCR-Funktion zu verstehen und neue Medikamente zu entwickeln. Zukünftige Pläne des Konsortiums umfassen die Anwendung der Methode, um die Interaktion von NF-kB-Signalkomponenten zu untersuchen. Insgesamt ermöglicht das erzeugte Verfahren die direkte Beurteilung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen in Zellen in Echtzeit und hat das Potential, Kristallgraphie-Daten zu Proteinstruktur und -funktion zu ergänzen.
Schlüsselbegriffe
Protein, Ligand, Kinase, Photon-aktivierte Aminosäuren, GPCR, Ucn1
