L’interazione fra le proteine in tempo reale
Le proteine sono elementi fondamentali nella maggior parte dei processi cellulari e spesso mediano le loro funzioni attraverso le interazioni con altre proteine, perciò è importante individuare metodi che permettano di studiare le interazioni tra le proteine all’interno delle cellule. Il progetto KINASE CROSSLINKING (Capturing kinase-substrate pairs in intact mammalian cells by using unnatural amino acid mutagenesis and photocrosslinking), finanziato dall’UE, ha lavorato a questo scopo, proponendo l’introduzione nelle proteine di aminoacidi attivati da fotoni per studiare la loro interazione con altre molecole. Dopo l’irradiazione con raggi ultravioletti, questi aminoacidi possono creare un legame incrociato tra la proteina e il suo substrato. In particolare, l’interesse dei ricercatori si è rivolto verso le chinasi, gli enzimi responsabili della fosforilazione delle proteine che svolgono un ruolo fondamentale nei percorsi di trasduzione. Come primo passo, il team ha sviluppato un nuovo sistema di espressione versatile che ha reso possibile la produzione ricombinante di proteine geneticamente modificate con derivati di tirosina attivati da fotoni. Per mantenere la struttura delle proteine, gli scienziati hanno eseguito lo screening di varie posizioni attraverso la protein chinasi, sia all’interno della tasca catalitica sia in prossimità di essa, per verificare l’idoneità all’incorporazione del reticolante. Come dimostrazione di questo principio, il team ha studiato l’interazione tra il recettore di tipo 1 del fattore di rilascio della corticotropina (CRF1R), un recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) di classe B, e il relativo ligando di peptidi Urocortina-I (Ucn1). L’introduzione dell’aminoacido fotoattivato in CRF1R ha permesso di chiarire i determinanti molecolari responsabili dell’attivazione del GPCR mediata da ligando. Modificando la posizione degli aminoacidi attivati dai fotoni, i ricercatori hanno ottenuto una mappa d’insieme della tasca di legame dei peptidi e informazioni strutturali sul recettore. Considerato che i GPCR costituiscono importanti obiettivi farmacologici, i dati ottenuti chiariranno meglio la loro funzione e consentiranno di sviluppare nuovi ritrovati farmaceutici. Per il futuro, il consorzio prevede di applicare questo metodo allo studio dell’interazione dei componenti di segnalazione NF-kb. Nel complesso, la metodologia che è stata ottenuta permette di valutare direttamente in tempo reale le interazioni fra proteine e ligandi all’interno delle cellule e potrà costituire un’integrazione dei dati ricavati dalla cristallografia sulla struttura e la funzione delle proteine.
Parole chiave
Proteina, ligando, chinasi, aminoacidi attivati da fotoni, GPCR, Ucn1