Make it, don’t break it: a reconstitution screen for Casparian strip formation in the root endodermis

Projektbeschreibung

Entwirrung von redundanten und multiplen Funktionen bei komplexen Gen-Interaktionen

Die Kompartimentierung ist ein allgemeines Organisationsprinzip von lebenden Organismen und tritt auf allen Ebenen auf – von Organellen und Zellen bis hin zu Gewebe, Organen und dem Organismus als Ganzes. In der Endodermis von Wurzeln höherer Pflanzen stellen die sogenannten Caspary-Streifen eine extrazelluläre Diffusionsbarriere innerhalb der Pflanzenwurzeln dar, ähnlich wie die Zonula occludens in tierischen Epithelzellen. Sie wirken gewissermaßen als Umleitung, durch die Wasser und Nährstoffe gezwungen sind, über die Transportproteine der Plasmamembran in die Zellen einzudringen. Im Verlauf der letzten zehn Jahre ist die Forschung bei der Identifizierung der Proteine, die zur Bildung der Caspary-Streifen nötig sind, erheblich vorangekommen. Diese Fortschritte sind inzwischen jedoch zum Erliegen gekommen, was sich vor allem auf die Existenz von multiplen Genen mit der gleichen Funktion (Redundanz) und Genen mit multiplen Funktionen zurückführen lässt. Das EU-finanzierte Projekt Wall-E arbeitet daran, ein innovatives Screening-Verfahren zu entwickeln, mit dem sich die minimale Genmenge anhand des Caspary-Streifens als Modellsystem identifizieren lässt und der möglicherweise auch bei anderen Vorgängen und Organismen zum Einsatz kommen könnte.

Ziel

In plants, the root endodermis functions as a barrier, allowing the selective uptake of nutrients and water. The barrier is formed by cell wall impregnations called Casparian strips (CS), produced by differentiating endodermal cells. In the last decade, pioneering work on the endodermis has identified numerous players involved in CS formation, including transmembrane proteins, peroxidases, dirigent-like proteins, lignin polymerising enzymes, laccases and super-oxide dismutases. However, the forward and reverse genetic approaches used to uncover these proteins are slowly coming to a standstill due to their limitations when faced with gene redundancy or genes with a broader range of activities, causing pleiotropy or lethality. I now propose to use CS formation as a model in order to pioneer a combinatorial, gain-of-function screen, aiming to define a minimally sufficient gene set for the assembly of a CS. I will attempt to reconstitute a CS in the endodermis of the myb36 mutant – a master regulator of endodermal differentiation - by activation screening for genes within the MYB36-dependent gene set. Firstly, I will introduce a “core machinery” for CS formation by expressing important known players and assessing CS formation and stability (WP1). Secondly, I will test the most recently developed second generation CRISPR activator systems for their efficiency in activating genes of interest in the endodermis (WP2). Thirdly, using the CRISPR activator technology, I will screen for novel genes that will improve the formation, stability and functionality of the CS (WP3). Identifying new genes involved in CS formation through a combinatorial, gain-of-function approach represents a novel way to genetically elucidate molecular mechanisms and could become a model for other cellular and developmental processes in Arabidopsis or other organisms.