Verbesserung der Proteinexpression in Bakterien
Bei eukaryotischen Zellen sind integrale Membranproteine (IMP) für das Empfangen und Verarbeiten von Signalen aus der Umgebung zuständig. IMP sind aber immer schwer zu analysieren, da kaum ausreichende Mengen stabiler und funktioneller Proteine zur Verfügung stehen. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), eine der größten IMP-Familien, bilden auch eine wichtige Klasse therapeutischer Zielstrukturen für die pharmazeutische Forschung. Escherichia coli ist ein gängiger Wirtsorganismus für die heterologe Proteinexpression, die Wirksamkeit und Ausbeute der GPCR ist allerdings für Studien zur Proteincharakterisierung zu gering. Das EU-finanzierte Projekt BIOIMPROVE (Lessons from the genome of Escherichia coli: understanding heterologous expression of eukaryotic internal membrane proteins in bacterial cells) sollte diese Einschränkung überwinden und die Prozesse untersuchen, die Einfluss auf die bakterielle Biogenese von IMP haben. Schwerpunkt dabei waren Gene, die die heterologe Produktion eukaryotischer IMP regulieren. Die Wissenschaftler arbeiteten mit einem System, das auf der Anreicherung von Zellen basiert, die hohe Konzentrationen von funktionellen GPCR exprimieren, sowie Bakterienstämmen mit verschiedenen mutierten Funktionen. In den Laborversuchen konnten spezifische bakterielle Varianten mit erhöhter GPCR-Expression identifiziert werden. Eine genetische Analyse dieser Varianten zeigte, dass ein Nucleotid im rpoD-Gen substituiert wird, das für die Sigma-70-Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert. Während des exponentiellen Wachstums leitet dieser Faktor die Polymerase zu Genen hin, die normales Wachstum gewährleisten. Die identifizierte Sigma-Mutante legt nahe, dass durch eine Erhöhung der Transkriptionsaktivierung toxische Effekte bei der Expression des Rezeptors verringert werden könnten. Eine Analyse der Genexpression ließ bedeutsame Veränderungen in den Stoffwechselwegen der rpoD-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Bakterien erkennen. Die Forschungsergebnisse von BIOIMPROVE erweitern den Wissensstand zur heterologen Expression von IMP in Bakterien, was einen Meilenstein zur Optimierung der GPCR-Produktion darstellt und enorm wichtig für künftige strukturelle und funktionelle Analysen dieser therapeutischen Zielstrukturen ist.
Schlüsselbegriffe
Integrale Membranproteine, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, Escherichia coli, rpoD, Sigma-Faktor
