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Novel genetic engineering approaches for lineage analysis and exploration of Akt function in cortical development

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L’etichettatura combinatoria delle cellule nervose

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi coinvolge l’interazione coordinata di cellule di diverse origini. Un progetto finanziato dall’UE ha studiato lo sviluppo della corteccia cerebrale, utilizzando una strategia di etichettatura multicolore multiclonale.

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La corteccia cerebrale, ovvero lo strato esterno del tessuto neurale del cervello dei mammiferi, ha numerose funzioni, tra cui la memoria, l’attenzione e il linguaggio. Le minicolonne corticali sono le unità funzionali fondamentali della corteccia; ciascuna comprende circa cento neuroni. Le minicolonne si sviluppano da cellule progenitrici all’interno dell’embrione. Finora, è stato difficile marcare simultaneamente più progenitori neurali con etichette distinte e tracciarne i discendenti per lunghi periodi di tempo. Il progetto BRAINBOWAKT (Novel genetic engineering approaches for lineage analysis and exploration of Akt function in cortical development), finanziato dall’UE, ha applicato un metodo rivoluzionario per tracciare singole cellule neurali. Nel processo Brainbow sviluppato, le singole cellule nel cervello potevano essere distinte dai neuroni vicini utilizzando proteine fluorescenti. Gli scienziati hanno sviluppato nuove tecniche di ingegneria genetica, per marcare multipli progenitori vicini e i loro discendenti in vivo con etichette non ambigue. I costrutti Brainbow che esprimono una tavolozza più ampia di marcatori tricromatici (proteine fluorescenti rosse, gialle e ciano) sono stati indirizzati a specifici comparti subcellulari. Tali transgeni sono stati introdotti nel proencefalo murino embrionale tramite elettroporazione. È stato possibile etichettare cellule progenitrici su vari cicli di divisione cellulare e tracciare i relativi discendenti fino agli stadi adulti. La generazione di topi transgenici con i nuovi costrutti Brainbow ha permesso di etichettare progenitori neurali in stadi e in ubicazioni in cui non si può eseguire l’elettroporazione. Brainbow è stato ulteriormente sviluppato per modulare la funzione di proteine candidate in vivo. Il risultato finale è stato un mosaico genetico in cui lo stato di espressione genica nelle cellule è stato segnato con codice colore. L’approccio permette di tracciare nello stesso campione cellule vicine con diversi livelli di espressione genica. La strategia creata permette in definitiva lo studio dell’architettura cellulare nel processo di formazione di minicolonne. Le attività BRAINBOWAKT hanno portato allo sviluppo di un utile modello animale e strategie applicabili per lo studio dei tessuti intatti in molti contesti biologici.

Parole chiave

Etichettatura combinatoria, corteccia cerebrale, progenitori neurali, BRAINBOWAKT, analisi del lignaggio

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