Le molecole di DNA analizzate a livello di femtogrammo
Il progetto DNALIGHTMAP (Mapping structural variation on native chromosomal DNA – a single molecule approach) ha sviluppato una serie di strumenti che permettono di visualizzare e di analizzare il DNA a livello di femtogrammo (1 mg equivale a 100 milioni di femtogrammi). Una delle aree di attenzione è costituita dal materiale genetico responsabile della distrofia muscolare facio-scapolo-omerale (FSHD). I ricercatori del team DNALIGHTMAP hanno sviluppato una tecnica per la clonazione delle sequenze genomiche batteriche lunghe, fino a 110 kB in un solo passaggio. La clonazione dei segmenti genetici lunghi è essenziale nella ricerca dell’ingegnerizzazione delle sostanze farmaceutiche, ma risulta particolarmente difficile e costosa se realizzata con i metodi tradizionali. Per analizzare e svolgere il DNA, il nuovo metodo utilizza le metiltrasferasi del DNA in combinazione con cofattori sintetici che permettono di ottenere una mappa di riferimento fluorescente. Il team ha lavorato sulla mappatura completa del genoma umano, analizzando i geni che provocano l’FSHD. Come strumento di confronto tra i geni sani e quelli mutati, i ricercatori hanno ritagliato regioni specifiche del DNA per condurre l’analisi genetica ed epigenetica. La nuova tecnica è stata brevettata e concessa in licenza ed è stata pubblicata su Nature Communications(si apre in una nuova finestra). Il team ha creato una nuova tecnica per la marcatura fluorescente della 5-idrossimetilcitosina (5-hmC), un modulatore chiave dell’espressione genetica in un contesto epigenetico. L’ulteriore sviluppo ha portato a un test ad alto rendimento e con piastra a più pozzetti per l’analisi contemporanea di oltre 300 campioni. I danni subiti dal DNA sono indissolubilmente legati alle malattie, in particolare al cancro. Adattando metodologie già sviluppate, i ricercatori hanno creato una tecnica a singola molecola che permette di visualizzare e quantificare direttamente i siti danneggiati sulle molecole di DNA distese. Per i danni da irraggiamento UV, hanno inoltre seguito le dinamiche di riparazione delle cellule dei pazienti di xeroderma pigmentoso che mancano di un solo enzima. Il protocollo viene attualmente utilizzato in vari laboratori di tutto il mondo per lo studio dei danni del DNA. L’identificazione dei batteriofagi è ora possibile grazie a un nuovo metodo di profilazione fluorescente di un’impronta molecolare che può essere esteso a qualsiasi campione di DNA. I dettagli di questi nuovi metodi rivoluzionari per l’analisi del DNA sono stati pubblicati sulle riviste American Chemical Society(si apre in una nuova finestra) e Nucleic Acids Research(si apre in una nuova finestra). Poiché la struttura del DNA e la sua epigenetica si trovano alla base di molte malattie, la ricerca condotta dal team DNALIGHTMAP presenta applicazioni molto ampie per la diagnosi e le terapie.
