I tempi del fato cellulare nell’embrione in fase di sviluppo
Dopo la fertilizzazione, già nell’embrione costituito da 32-64 cellule è possibile identificare cellule di diverso tipo. Gli scienziati, tuttavia, non sono ancora concordi sul fatto che esistano differenze evolutive in gioco già prima dell’induzione della pluripotenza nella massa cellulare interna (MCI) destinata a diventare l’embrione o nel trofoectoderma (TE) da cui deriva la placenta. Durante la ricerca precedente, il team SIEAVD aveva creato un test per analizzare la progressione dello sviluppo precedente all’impianto. Il test FDAP (fluorescence decay after photoactivation, decadimento della fluorescenza dopo la fotoattivazione) permetteva di eseguire l’analisi quantitativa del fattore di trascrizione chiave Oct4 che controlla lo sviluppo prima dell’impianto nelle diverse fasi dell’embrione dei topi. Il progetto SIEAVD, finanziato dall’UE, ha utilizzato in modo sistematico strumenti di imaging avanzato per rilevare i primissimi segnali di differenze evolutive che permettono di predire eventi di patterning dei ceppi cellulari. Un aspetto particolarmente interessante è stata la possibilità da parte dei ricercatori di prevedere la pluripotenza dell’embrione fin dalla fase a 4 cellule. Le cellule con cinetica Oct4 lenta e una frazione immobile elevata erano molto probabilmente destinate a diventare parte della MCI, mentre la maggior parte delle cellule con cinetica Oct4 rapida sarebbero diventate parte del TE. Per approfondire ulteriormente la dinamica proteica in gioco, i ricercatori hanno utilizzato l’imaging in vivo per visualizzare le pcFP (photoconvertible fluorescent protein, proteine fluorescenti fotoconvertibili) da verde a rosso. In questo modo, non solo è stato possibile realizzare un’indagine ad alto rendimento ma gli scienziati del progetto hanno anche potuto tracciare in parallelo le popolazioni di proteine sia verdi sia rosse. Il team SIEAVD ha sfruttato la minore fototossicità resa possibile dal ricorso al metodo di conversione con priming e perfezionando questo processo ha aperto alla possibilità di una selezione non invasiva ad alto contrasto delle cellule e delle proteine desiderate. Scoprendo il meccanismo molecolare della conversione con priming, i ricercatori hanno creato varianti convertibili con priming dei pcFP verde-rossi più noti, oltre a vari sensori fotoconvertibili e modulatori di attività. In questo modo è stato possibile aumentare in modo significativo il numero di proteine tracciabili da una a tutte le pcFP degli antozoi. Il progetto ha utilizzato una conversione con priming perfezionata come strumento estremamente efficace per esaminare l’emergere dell’asimmetria nell’embrione dei mammiferi. Una volta stabilito che l’imaging volumetrico veloce convertibile con priming è il metodo più efficace, è ora possibile concentrarsi sullo sviluppo di tutti i blastomeri dei topi grazie al livello di precisione, temporale e spaziale, senza precedenti che assicura questo strumento.
Parole chiave
Embrione in sviluppo, pluripotenza, SIEAVD, imaging, conversione con priming
