Descrizione del progetto
Chiarire il meccanismo di formazione delle triple eliche dell’RNA
Gli RNA lunghi non codificanti costituiscono gran parte del trascrittoma umano. Queste molecole di RNA interagiscono con la cromatina per la regolazione dell’espressione genica tramite la formazione di triple eliche. Nonostante lo svolgimento di numerose ricerche in vitro, i meccanismi di fondo che sovrintendono alla formazione della tripla elica rimangono sconosciuti. Il progetto triloci-seq, finanziato dal programma di azioni Marie Skłodowska-Curie, sta lavorando su una tecnica di sequenziamento innovativa di prossima generazione volta alla codifica in vivo del codice della tripla elica. Il successo del progetto dipende dalla disponibilità di genomi di mammiferi in grado di ospitare centinaia di migliaia di presunti siti bersaglio ad alta affinità di triple eliche, nonché di oligonucleotidi contenenti basi miste. Insieme, tali risorse dovrebbero permettere agli scienziati di superare l’ostacolo più grande nello studio della formazione delle triple eliche, ovvero la necessità di abbinare un sito bersaglio in modo specifico al suo oligonucleotide formante triple eliche.
Obiettivo
Recent technological advances revealed that there are many long non (protein)-coding RNA molecules (lncRNA) transcribed in the genome, many of whom regulate gene expression. However, it remains unclear how lncRNA molecule can interact directly with chromatin to regulate gene expression. One possibility that has been raised is via the formation of triple-helices. The potential for the formation of triple helices exists in any nucleic acid chain via an interaction called Hoogsteen base-pairing. However, unlike the genetic code or even Watson-Creek base-pairing, the triplex code or sequences which can function as triplex target sites and triplex-forming oligos is poorly understood. To decipher the triplex code in vivo, I propose a novel research approach based on next generation sequencing that I call Triloc-seq (in vivo). The feasibility this research plan relies on two crucial resources: first, mammalian genomes which can harbor as many as hundreds of thousands of putative high-affinity triplex target sites (TTSs), and second mixed-base oligo synthesis technology. Together these resources will allow us to over-come the greatest obstacle in triplex study, the need to match specifically a target site with its triplx forming oligo (TFO). To study the triple-helix code, we will transfect mammalian cells with a TFO libraries, and use click chemistry to join the TFO to its target site. We will then use previous TFO-TTS data obtained in vitro and multiple advanced bioinformatic approaches to extract the genomic TTSs. Finally, to prove that triplex interaction can be functional in vivo, we will design several applications that will test this functionality. In all cases we will design a cassette of known TTS target sites and position it upstream of a minimal promoter. The TTS cassette will be targeted by natural lncRNAs containing matching TFO segments, synthetic TFO-VP64 hybrids synthesized in vitro, and fluorescently labelled TFOs to confirm TTS-TFO functionality.
Campo scientifico (EuroSciVoc)
CORDIS classifica i progetti con EuroSciVoc, una tassonomia multilingue dei campi scientifici, attraverso un processo semi-automatico basato su tecniche NLP. Cfr.: https://op.europa.eu/en/web/eu-vocabularies/euroscivoc.
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- scienze naturaliscienze biologichebiochimicabiomolecoleacidi nucleici
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