La mappatura senza marchio delle biomolecole nel tessuto cerebrale
L’IMS permette la rilevazione e la mappatura senza marchio di una vasta gamma di sostanze biologicamente rilevanti, agendo come una scienza relativa, che fornisce risposte normalizzate in riferimento a uno standard. La quantificazione relativa delle sostanze farmaceutiche è possibile se i fattori di risposta dell’IMS (rapporto tra il segnale e la quantità dell’analita) sono noti. Non è possibile, tuttavia, conoscere a priori il fattore di risposta IMS per ogni singolo peptide o proteina. Il progetto ENIGMAS (Explicitly normalized imaging mass spectrometry), finanziato dall’UE, ha affrontato questo problema che rappresenta il maggiore ostacolo a una diffusa applicazione clinica di questa potente tecnica. Il lavoro pionieristico svolto dal team ha portato allo sviluppo di un metodo per la normalizzazione esplicita di ogni peptide rilevato durante gli esperimenti di IMS. I componenti del team hanno impiegato un recente modello di ratto sfruttando la marcatura con isotopi stabili tramite aminoacidi in coltura cellulare (SILAC). La tecnica SILAC per colture proteomiche basate su spettrometria di massa quantitativa coltiva le cellule in supporti identici, con l’eccezione degli aminoacidi presenti. Uno contiene aminoacidi senza marcatura e uno aminoacidi (normalmente la lisina) con marcatura. La versione con il ratto prevedeva l’inserimento della lisina marcata nella dieta seguita dall’animale. I ricercatori hanno utilizzato la tecnica per creare uno standard di riferimento nei ratti in cui tutti i residui di lisina 12C6 erano sostituiti con lisina 13C6. La digestione triptica dell’estratto di proteine SILAC ha prodotto peptidi triptici contenenti un’unica lisina 13C6. La digestione del tessuto normale dei ratti ha prodotto peptidi contenenti lisina 12C6, che sono stati confrontati con lo standard, in modo da normalizzare le immagini di tutti i peptidi triptici tramite i corrispondenti analoghi marcati isotopicamente. Oltre alle tecniche di preparazione dei campioni, il team ENIGMAS ha sviluppato un vasto database di peptidi e proteine basati sull’IMS delle sezioni di tessuto cerebrale dei ratti, elaborandolo tramite una pipeline di analisi automatizzata basata su tecniche di bioinformatica. Questa tecnologia ha consentito di conoscere meglio i cambiamenti biomolecolari spaziali e temporali del cervello dei ratti in base a un modello animale di emicrania. Il nuovo strumento della famiglia IMS favorirà notevolmente la conoscenza dei modelli animali delle malattie neurologiche. L’allineamento dei set di dati di imaging con un atlante ad alta risoluzione ed esteso all’intero genoma dell’espressione genetica permetterà di ampliare ulteriormente le capacità, collegando i cambiamenti biomolecolari con l’espressione genetica.
Parole chiave
Mappatura senza marchio, biomolecole, tessuto cerebrale, imaging con spettrometria di massa, fattori di risposta
