La evolución dirigida para mejorar el diseño de fármacos selectivos
Los receptores acoplados a proteínas G de clase B (GPCR) son receptores que se unen a hormonas peptídicas e intervienen en el desarrollo de diversas enfermedades humanas, lo que los convierte en posibles dianas farmacológicas. El estudio en profundidad de su estructura molecular, mediante cristalografía de rayos-X o espectroscopía de resonancia magnética nuclear, requiere grandes cantidades de proteína. Los GPCR presentan una expresión endógena baja y son muy inestables en solución, por lo que es necesario mejorar las condiciones de expresión de estas proteínas. El objetivo del proyecto GPCR EVOLUTION (Directed evolution of class B G-protein coupled receptors), financiado con fondos europeos, consistió en optimizar los GPCR humanos de clase B para aumentar su expresión y termoestabilidad. Se empleó la evolución dirigida, una combinación de mutaciones introducidas de forma aleatoria y posterior selección del fenotipo deseado. En Escherichia coli se expresó de forma aleatoria un gran número de genes de receptores, los GPCR funcionales se dirigían la cara la membrana interna. Mediante citometría de flujo con ligandos marcados fluorescentemente se identificaron los mutantes que presentaban mayor expresión de receptores y unión al ligando. Tras ciclos repetitivos de aleatorización y selección se aumentó progresivamente el grado de expresión proteica y la estabilidad. Durante el proyecto, se creó un sistema de selección general con objeto de superar las dificultades derivadas de las propiedades desfavorables del ligando. Además, se generó un grupo de vectores de expresión nuevo que permitió una puesta a punto rigurosa de la expresión proteica a nivel unicelular. Estos vectores podrían resultar útiles para proteínas de difícil expresión. El equipo de GPCR EVOLUTION logró identificar un grupo de mutaciones que conferían mayor expresión y termoestabilidad a los GPCR de clase B. Se caracterizaron los mutantes en función de su unión al ligando y sus propiedades de señalización. Gracias a los mutantes de GPCR de clase B que presentan propiedades mejoradas se podrá continuar con el estudio biofísico de estas proteínas.
