Kierowana ewolucja w produkcji leków celowanych
Receptory sprzężone z białkami G (GPCR) klasy B są peptydowymi receptorami wiążącymi hormony. Ich rola w szeregu chorób ludzi czyni z nich ważne potencjalne cele dla leków. Szczegółowe poznanie ich struktury molekularnej jest możliwe poprzez krystalografię rentgenograficzną lub spektroskopię NMR, ale metody te wymagają dużych ilości białka. Jako że GPCR wykazują niską endogenną ekspresję i są bardzo niestabilne w roztworze, konieczne jest znalezienie ulepszonych warunków ekspresji tych białek. Uczestnicy finansowanego przez UE projektu GPCR EVOLUTION (Directed evolution of class B G-protein coupled receptors) mają na celu optymalizację ludzkich GPCR klasy B, aby zwiększyć ich ekspresję i termostabilność. Naukowcy użyli kierowanej ewolucji, tj. kombinacji losowo wprowadzonych mutacji i dalszego wyboru pożądanego fenotypu. W Escherichia coli dokonano ekspresji dużych bibliotek randomizowanych genów receptorowych, z funkcjonalnym GPCR nacelowanym na ich wewnętrzną błonę komórkową. Cytometria przepływowa przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych ligandów pozwoliła naukowcom znaleźć mutanty przejawiające zwiększony poziom ekspresji receptorów i wiązania ligandów. Powtarzane cykle randomizacji i selekcji stopniowo zwiększyły poziom ekspresji i stabilność białek. W trakcie realizacji projektu ustanowiono odrębny system selekcji w celu przezwyciężenia ograniczeń spowodowanych przez niekorzystne właściwości ligandów. W dodatku nowo stworzone zestawy wektorów do ekspresji pozwoliły na ścisłą regulację ekspresji białkowej na poziomie pojedynczej komórki. Takie wektory będą użyteczne w przypadku wszystkich trudnych w ekspresji białek. Projekt GPCR EVOLUTION umożliwił znalezienie zestawu mutacji ulepszających ekspresję i termostabilność GPCR klasy B. Scharakteryzowano mutanty ze względu na właściwości wiązania ligandów i przekazywania sygnałów. Ulepszone właściwości mutantów GPCR klasy B pozwolą badaczom kontynuować ich charakteryzację biofizyczną.
