L’evoluzione diretta per un migliore targeting dei farmaci
I recettori accoppiati a proteine G di classe B (GPCR) sono recettori che legano ormoni peptidici coinvolti in diverse malattie umane, e sono quindi importanti bersagli potenziali per la terapia farmacologica. Una comprensione dettagliata della loro struttura molecolare, ottenibile tramite cristallografia a raggi X o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, richiede grandi quantità di proteine. Poiché i GPCR presentano una ridotta espressione endogena e sono molto instabili in soluzione, è necessario trovare migliori condizioni di espressione per queste proteine. Il progetto GPCR EVOLUTION (Directed evolution of class B G-protein coupled receptors), finanziato dall’UE, mirava a ottimizzare i GPCR umani di classe B per una migliore espressione e maggiore termostabilità. Gli scienziati hanno utilizzato l’evoluzione diretta, una combinazione di mutazioni introdotte casualmente con conseguente selezione del fenotipo desiderato. Grandi librerie di geni recettori randomizzati sono stati espressi in Escherichia coli, con GPCR funzionali indirizzati sulla membrana cellulare interna. La citometria a flusso con impiego di ligandi marcati a fluorescenza ha permesso agli scienziati di trovare i mutanti che presentavano livelli aumentati di espressione dei recettori e formazione di legami con i ligandi. Cicli ripetitivi di randomizzazione e selezione hanno gradualmente aumentato il livello di espressione e stabilità delle proteine. Nel corso del progetto è stato creato un sistema di selezione generico per superare le restrizioni causate dalle caratteristiche sfavorevoli dei ligandi. Inoltre un nuovo set di vettori di espressione ha permesso il rigoroso perfezionamento dell’espressione delle proteine a livello di singole cellule. Tali vettori sarebbero preziosi per tutte le proteine di difficile espressione. GPCR EVOLUTION è riuscito a trovare una serie di mutazioni che conferisce migliori espressione e termostabilità ai GPCR di classe B. I mutanti sono stati caratterizzati per la creazione di legami con i ligandi e per le proprietà di segnalazione. Le proprietà migliorate dei mutanti GPCR di classe B permetteranno ai ricercatori di proseguire nella loro caratterizzazione biofisica.
Parole chiave
Evoluzione diretta, targeting dei farmaci, espressione delle proteine, recettori accoppiati a proteine G, termostabilità