Gerichtete Evolution für gezieltere Wirkstoffe
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) der Klasse B sind Peptidhormon-bindende Rezeptoren, die an mehreren menschlichen Krankheiten beteiligt sind, was sie zu wichtigen potenziellen Zielen für die Arzneimitteltherapie macht. Für detaillierte Analysen der molekularen Struktur mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie werden jedoch große Mengen des jeweiligen Proteins benötigt. Da GPCR endogen nur in geringen Mengen exprimiert werden und in Lösung sehr instabil sind, müssen Bedingungen für die Expression dieser Proteine verbessert werden. Das EU-finanzierte Projekt GPCR EVOLUTION (Directed evolution of class B G-protein coupled receptors) zielte sollte humane Klasse-B-GPCR für eine erhöhte Expression und Thermostabilität optimieren. Gearbeitet wurde mit gerichteter Evolution, einer Kombination aus zufällig eingeführten Mutationen und anschließender Selektion des gewünschten Phänotyps. In Escherichia coli wurden große Bibliotheken randomisierter Rezeptorgene exprimiert, wobei funktionelle GPCR zur inneren Zellmembran geleitet wurden. Mittels Durchflusszytometrie mit fluoreszenzmarkierten Liganden konnten Mutanten mit höherer Rezeptorexpression und Ligandenbindung identifiziert werden. Durch wiederholte Zyklen von Randomisierung und Selektion konnte dann nach und nach das Niveau der Proteinexpression und -stabilität erhöht werden. Im Verlauf des Projekts wurde ein generisches Selektionssystemsystem eingerichtet, um Einschränkungen durch ungünstige Bindungseigenschaften zu umgehen. Zudem wurde mit einem neu entwickelten Set von Expressionsvektoren eine genaue Feinabstimmung der Proteinexpression auf Einzelzellebene erreicht. Vektoren dieser Art eignen sich künftig für alle schwierig zu exprimierenden Proteine. GPCR EVOLUTION enthüllte eine Reihe von Mutationen, die bei Klasse-B-GPCR die Expression und Thermostabilität erhöhen können. Bei den Mutanten wurden Ligandenbindung und Signaleigenschaften charakterisiert. Mit den verbesserten Eigenschaften von Klasse-B-GPCR-Mutanten dürfte deren biophysikalische Charakterisierung künftig sehr viel einfacher werden.
