Descrizione del progetto
Il meccanismo di arresto irreversibile della forca di replicazione
La replicazione del DNA è essenziale per la proliferazione cellulare e qualsiasi ostacolo a tale processo provoca uno stress di replicazione che blocca le forche di replicazione. In risposta a ciò, le cellule attivano un meccanismo di checkpoint da danno al DNA per prevenire danni al DNA e garantire la sopravvivenza cellulare. La funzione essenziale del checkpoint è quella di stabilizzare le forche di replicazione in modo da garantire che la replicazione riparta dopo che sono stati rimossi gli ostacoli. Il checkpoint della chinasi Rad53 nel lievito e il suo analogo umano Chk1 sono coinvolti nella prevenzione dell’arresto della forca di replicazione irreversibile e della morte cellulare causata da stress di replicazione. Il progetto Irrev Fork Arrest, finanziato dall’UE, impiegherà la ricostruzione della replicazione in vitro con proteine purificate del lievito per determinare le attività delle proteine ed enzimatiche richieste per promuovere l’arresto irreversibile della forca di replicazione in assenza del checkpoint.
Obiettivo
DNA replication is essential for cell proliferation. Obstacles to replication generate replication stress by stalling replication forks. In response to replication stress, cells activate the DNA damage checkpoint pathway that coordinates a cellular response to prevent DNA damage and ensure cell survival. One essential function of the checkpoint is to stabilise stalled replication forks and ensure that replication will resume after obstacles are removed. Specifically, the yeast checkpoint effector kinase Rad53 and its human counterpart Chk1 are essential to prevent irreversible replication fork arrest (IRFA), DNA damage and cell death under replication stress. A screen to identify factors required to promote IRFA has revealed a role for unrestricted recombination events in promoting IRFA. However, mechanistic studies are still required to understand how the checkpoint stabilises stalled forks and prevents IRFA. Recently, in vitro replication reconstitution with yeast purified proteins in the lab has helped uncover important mechanisms of DNA replication. I will use this system to reconstitute IRFA in vitro and determine the proteins and enzymatic activities required to promote IRFA in the absence of the checkpoint. I will then look for phosphorylation targets of Rad53 to understand how the checkpoint prevents IRFA. I will study changes at the DNA and replisome of stalled replication forks by 2D electrophoresis, mass spectrometry and cryo-EM to understand the causes of the irreversibility of IRFA. We seek to better characterise an essential function of the DNA damage checkpoint and define a new role for unrestricted recombination in promoting DNA damage. Main challenges of current cancer therapies include the appearance of surviving checkpoint-deficient cancer cells. Despite constant replication stress, it is unknown why these cells do not suffer irreversible fork arrest. Understanding IRFA could help design new therapies to target checkpoint-deficient cancer cells.
Campo scientifico (EuroSciVoc)
CORDIS classifica i progetti con EuroSciVoc, una tassonomia multilingue dei campi scientifici, attraverso un processo semi-automatico basato su tecniche NLP. Cfr.: https://op.europa.eu/en/web/eu-vocabularies/euroscivoc.
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