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Investigation of human nucleoporins stoichiometry and intracellular distribution by quantitative mass spectrometry

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Quantifizierung menschlicher Nukleoporine

Über Kernporen werden jede Minute Tausende wasserlöslicher Moleküle durch die Kernmembran geschleust. Ein EU-Projekt enthüllte nun anhand der einzelnen Bausteine die Struktur des Kernporenkomplexes (NPC).

Gesundheit

Der NPC ist ein Kanalkomplex in der Kernmembran, der den Austausch von Molekülen zwischen Kern und Zytoplasma reguliert und aus ca. 30 Bausteinen ​​oder Nukleoporinen besteht. Genauere Informationen zum Aufbau des NPC, anhand derer sich Strukturmodelle in atomarer Auflösung erstellen lassen, stehen allerdings noch aus. Schwerpunkt des EU-finanzierten Projekts NPCQUANT (Investigation of human nucleoporins stoichiometry and intracellular distribution by quantitative mass spectrometry) waren daher stöchiometrische Analysen des NPC in menschlichen Zellen. Das Projekt entwickelte gezielte Proteomikassays für die genaue und reproduzierbare Quantifizierung aller 32 Nukleoporine. Anhand intakter Zellkerne und Kernmembranen, die aus mehreren Zellen isoliert worden waren, konnte der vollständig assemblierte NPC in situ stöchiometrisch analysiert werden. Strukturelle Untersuchungen erfolgten mittels Kryoelektronenmikroskopie. Nachdem der Aufbau des NPC bei mehreren Krebszelllinien verglichen wurde, zeigte sich, dass dieser bei den einzelnen Krebszelllinien aufgrund stöchiometrischer Veränderungen der peripheren Komponenten variierte. Die Projektforscher erzeugten stabile Zelllinien, die induzierbare microRNA für unterschiedliche Nukleoporine exprimieren und damit leistungsfähige Werkzeuge für strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Einzelkomponenten des NPC darstellen. NPCQUANT enthüllte die Struktur des NPC-Scaffolds, mit der sich die Strukturbiologie seit längerem intensiv befasst. Außerdem wurden spezifische Proteomik-Assays und Zelllinien generiert, mit denen die funktionelle Rolle einzelner Nukleoporine beim nukleären/zytoplasmatischen Transport charakterisiert werden kann.

Schlüsselbegriffe

Nukleoporin, Kernporenkomplex, Proteomik, Assay, Elektronenmikroskopie

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