Nuove tecniche per studiare la riparazione del DNA rotto
Chiarire il processo di riparazione del DNA è essenziale per lo sviluppo di terapie efficaci. Gli scienziati impegnati nel progetto SM-DNA-REPAIR (New single-molecule techniques and their application in the study of DNA break repair) hanno messo a punto strumenti e tecniche biofisiche per visualizzare la dinamica in tempo reale di riparazione del DNA a livello di singola molecola. I ricercatori si sono concentrati sulla AddAB elicasi nucleasi e la manutenzione strutturale del complesso di cromosomi (SMC) da Bacillus subtilis. Tali complessi sono coinvolti nella riparazione del DNA e aiutano a mantenere l’integrità del genoma. Qualsiasi interruzione del loro funzionamento potrebbe causare malattie mortali. Diverse tappe significative sono state raggiunte durante il corso del progetto. Gli scienziati hanno costruito un setup di pinzette ottiche e magnetiche utilizzando un microscopio ottico, una telecamera CCD e sfere magnetiche. Tale sistema è stato utilizzato per determinare le dinamiche di traslocazione AddAB e il ruolo cruciale delle sequenze di regolazione durante la resezione di rotture nella doppia elica del DNA. In particolare, gli studi hanno consentito una nuova comprensione dei meccanismi di riconoscimento dei crossover hotspot instigator (Chi), specifiche sequenze hotspot di ricombinazione. I risultati sono stati pubblicati in Molecular Cell nel 2011 e su PNAS nel 2013. I membri del progetto SM-rDNA-REPAIR hanno anche studiato le interazioni DNA-proteine a livello di singola particella dopo aver sviluppato un sistema di pinzette ottiche che utilizza video-microscopia e laser. Ciò ha consentito ai ricercatori di determinare le forze coinvolte in singole interazioni biotina-streptavidina nonché di misurare le curve forza-estensione di DNA a doppio filamento e RNA. I risultati sono stati pubblicati in JACS nel 2013. I ricercatori hanno modificato con successo un microscopio a forza atomica (AFM) commerciale per l’imaging del DNA in tampone liquido e aria alla velocità impressionante di un’immagine al secondo. Utilizzando tale sistema, i ricercatori sono stati in grado di ottenere una più profonda comprensione della reazione di resezione AddAB nonché della stechiometria dei complessi proteici come SMC. La competenza dei membri del progetto nel campo dell’imaging AFM si è rivelata preziosa in diverse collaborazioni di ricerca, con risultati in corso di pubblicazione su molte riviste ad alto impatto sottoposte a revisione paritaria. Gli argomenti comprendevano le dinamiche del doppio filamento di RNA, la caratterizzazione delle nanostrutture e il binding del peptide al DNA. Gli strumenti e le metodologie SM-DNA-REPAIR hanno applicazioni che vanno ben oltre lo studio dei meccanismi coinvolti nella riparazione del DNA. Tali strumenti potrebbero rivelarsi preziosi per l’ingegneria dei tessuti, l’ingegneria delle proteine e lo sviluppo di farmaci e biomateriali. Tali strumenti e metodologie possono anche essere adattati alla ricerca volta ad accrescere la sicurezza alimentare attraverso migliori incroci delle colture e riproduzione degli animali d’allevamento.
Parole chiave
Riparazione delle rotture nel DNA, biofisica, AddAB, SMC, pinzette magnetiche, Chi, pinzette ottiche, AFM