Nowe techniki analizy procesu naprawy przerwanego DNA
Wyjaśnianie procesu naprawy DNA ma kluczowe znaczenie w opracowywaniu skutecznych metod leczenia. Naukowcy pracujący w ramach projektu SM-DNA-REPAIR (New single-molecule techniques and their application in the study of DNA break repair) opracowali biofizyczne instrumenty i techniki wizualizacji dynamiki naprawy DNA w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej cząsteczki. Badacze skupili się na helikazie-nukleazie AddAB oraz konserwacji struktury kompleksów chromosomów (SMC) ze szczepów Bacillus subtilis. Te kompleksy związane są z naprawą DNA i pozwalają na utrzymanie integralności genomu. Każde zaburzenie ich funkcji może spowodować zagrażające życiu choroby. Podczas realizacji projektu udało się zrealizować szereg ważnych założeń badawczych. Naukowcy opracowali optyczno-magnetyczne szczypce korzystające mikroskopu optycznego, kamery CCD oraz kulek magnetycznych. Ten system został zastosowany do określenia dynamiki translokacji AddAB oraz kluczowej roli sekwencji regulacyjnych podczas resekcji przerwanego dwuniciowego DNA. Badania dostarczyły nowych informacji dotyczących mechanizmów rozpoznawania ognisk gorących miejsc zmiany (Chi) stanowiących określone sekwencje gorących miejsc rekombinacji. Wyniki zostały opublikowane w magazynie Molecular Cell w 2011 r. oraz w PNAS w 2013 r. Po opracowaniu szczypców magnetycznych korzystających z mikroskopii wideo oraz laserów uczestnicy projektu SM-DNA-REPAIR przeanalizowali również interakcje DNA-białko na poziomie jednej cząsteczki. Pozwoliło to naukowcom na określenie sił uczestniczących w interakcjach pojedynczej biotyny i strepawidyny oraz do pomiaru krzywych sił i wydłużenia w dwuniciowym DNA i RNA. Wyniki zostały opublikowane w magazynie JACS w 2013 r. Badacze z powodzeniem zmodyfikowali komercyjny mikroskop sił atomowych (AFM) do obrazowania DNA w buforze ciekłym oraz w powietrzu ze zdumiewającą szybkością jednego obrazu na sekundę. Korzystając z tego systemu, badaczom udało się lepiej zrozumieć reakcję resekcji AddAB oraz stechiometrię kompleksów białkowych takich jak SMC. Specjalistyczna wiedza uczestników projektu w obrazowaniu AFM okazała się nieoceniona w kilku zespołowych pracach badawczych, których wyniki zostały opublikowane w wielu prestiżowych czasopismach branżowych. Wśród poruszanych tematów znalazła się dynamika dwuniciowego RNA, charakterystyka nanostruktur oraz wiązania peptydów do DNA. Narzędzia i metodologie opracowane w ramach projektu SM-DNA-REPAIR mają zastawanie wychodzące poza badania mechanizmów uczestniczących w naprawie DNA. Narzędzia te mogą mieć duże znaczenie w inżynierii tkankowej, inżynierii białkowej oraz opracowywaniu biomateriałów. Ponadto narzędzia te można dostosować do badań nad zwiększaniem bezpieczeństwa życiowości poprzez skuteczniejszą uprawę roślin i hodowlę zwierząt.
Słowa kluczowe
Naprawa uszkodzonego DNA, biofizyczny, AddAB, SMC, szczypce magnetyczne, Chi, szczypce optyczne, AFM