Innovationen in der Mikroskopie offenbaren bislang unsichtbare biologische Merkmale
Konventionelle Mikroskopie hat aufgrund der Eigenschaften der Lichtwellen ihre Grenzen. Trifft Licht auf eine Oberfläche, wird es abgelenkt oder gebeugt, was letztlich bedeutet, dass es nur auf einen endlichen Punkt fokussiert werden kann. Bei den leistungsfähigsten optischen Mikroskopen hat dieser Punkt einen Durchmesser, der etwa der Hälfte der Wellenlänge des sichtbaren Lichts, d. h. weniger als 200 Nanometer, entspricht. Das vom Europäischen Forschungsrat unterstützte Projekt NanoChemBioVision hat zwei Methoden entwickelt, um eine Ultrahochauflösung über diese Beugungsgrenze hinaus zu erzielen. „Beide Verfahren erreichen auf einzigartige Weise eine Superauflösung, und das ganz ohne Fluoreszenzmarker, welche die Proben färben, beeinflussen oder genetisch verändern“, erklärt Projektkoordinator Sumeet Mahajan von der Universität Southampton, die Projektträger ist. „Diese biomedizinischen Anwendungen könnten erheblich zur Verbesserung der öffentlichen Gesundheit beitragen. Mit diesen Verfahren könnten zum Beispiel Viruspartikel, auch SARS-CoV-2, abgebildet werden, was Einblicke in ihre chemische Ausstattung und Struktur zulässt und so die Anstrengungen im Kampf gegen die Krankheit unterstützen würde.“ Bislang wurde ein Patent erteilt, eine weitere Patentanmeldung ist anhängig.
Subzellulär markierungsfrei ins Detail gehen
In den letzten zwanzig Jahren war nach der Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins und der Erfindung der optischen hochauflösenden Fluoreszenzmethoden eine explosionsartige Weiterentwicklung der biologischen Bildgebung zu verzeichnen. Die Biowissenschaft kann zelluläre Merkmale nun in bisher ungekannter Detailgenauigkeit abbilden. Fluoreszenzmarker beeinträchtigen jedoch die Abbildung einiger Funktionen und Merkmale. Die Schwingungsbildgebung stellt eine markierungsfreie Lösung dar und liefert gleichzeitig zusätzliche chemische sowie strukturelle Daten. Alle Moleküle schwingen auf charakteristische Weise und weisen somit molekulare „Fingerabdrücke“ auf. NanoChemBioVision nutzte Infrarotspektroskopie und Raman-Spektroskopie, um diese Fingerabdrücke auszulesen. Das Team untersuchte zudem ein weiteres markierungsfreies Verfahren mit Vervielfachung der Schwingungsfrequenz des eingestrahlten Lichts und Zwei-Photonen-Fluoreszenz, bei dem mithilfe zweier kombinierter Photonen spezifische Strukturen und Moleküle optisch abgebildet werden. NanoChemBioVision wandte diese markierungsfreien Verfahren sowohl auf Superoszillationsmethoden als auch auf photonische Nanojet-Methoden an. Beim erstgenannten Verfahren wird der ausgesandte Lichtstrahl geformt, indem er in Intensität und Zeit moduliert wird, um einen sehr kleinen Lichtpunkt für die Bildgebung zu erhalten. Das zweite nutzt die Wirkung von Mikrokugeln auf einen Lichtstrahl aus. Die aus einem dichteren Material als das Medium bestehenden Mikrokugeln fokussieren das Licht zu einem Lichtpunkt im Nanometerbereich. In mehreren Simulationen wurde Superoszillation in Standard-Einzel- und Mehrphotonenmikroskopen angewandt, um die optimalen Parameter für die Lichtmodulation einzustellen. Auf diese Weise konnte die durch Beugung begrenzte Auflösung um 30 % bis 70 % verbessert werden. Beispielsweise wurden mittels Superoszillationen in Kombination mit Zwei-Photonen-Fluoreszenz Goldnanopartikel abgebildet, wobei eine Auflösung jenseits ihrer Beugungsgrenze erzielt werden konnte. Das durch photonische Nanojets unterstützte Verfahren mit Schwingungsfrequenzverdopplung wurde auf biologische Proben wie etwa Kollagenfasern im Gewebe von Mäusen angewandt, was in einer bisher noch nie dagewesenen Detailgenauigkeit mündete. Die dabei erreichte Auflösung lag unterhalb von 125 Nanometern; somit war sie 2,3-mal besser als bei der beugungsbegrenzten Bildgebung. Mit dieser Methode wurden außerdem Lungenkrankheiten anhand von bildgebend dargestellten Proben von idiopathischer Lungenfibrose diagnostiziert. Es konnten Kollagenveränderungen im Nanometerbereich beobachtet werden, die für die beugungsbegrenzte Bildgebung bisher komplett unsichtbar waren. Es waren klare Unterscheidungen zwischen mit Wirkstoffen oder Wachstumsfaktoren behandelten Proben und gesunden Proben möglich. „Hier bieten sich neue Möglichkeiten der superaufgelösten Bildgebung von Gewebe und Zellen, die nicht nur markierungsfrei ist, sondern gleichzeitig chemische und strukturelle Informationen erfasst, die vorher unzugänglich waren“, sagt Mahajan. Das Team arbeitet nun zusammen mit Partnern am Optoelectronics Research Centre in Southampton an der Entwicklung von Verfahren, um die Kosten und die Größe der für die Mehrphotonen-Bildgebung erforderlichen Lasersysteme zu reduzieren. Sie steigern gleichermaßen die Empfindlichkeit des Systems und erweitern seine Fähigkeiten in Hinsicht auf ein vielseitiges Spektrum an Geweben, Zellen, Krankheiten und Symptomen. Zudem wird die Eindringtiefe der Verfahren vergrößert, um auch tiefere Gewebeschichten ultrahochauflösend abzubilden.
Schlüsselbegriffe
NanoChemBioVision, Mikroskope, Mikroskopie, Bildgebung, Photonen, Nano, COVID, Auflösung, Oszillation, Schwingung, Beugung, markierungsfrei, Licht
