Innowacje w dziedzinie mikroskopii ujawniają nieznane wcześniej cechy biologiczne
Zachowanie fal światła ogranicza możliwości konwencjonalnej mikroskopii. Gdy wiązka światła pada na powierzchnię, ugina się lub odbija się od niej, co oznacza, że może się ona skupiać jedynie w określonym punkcie. W przypadku najmocniejszych mikroskopów optycznych średnica tego punktu równa jest mniej więcej połowie długości fali światła widzialnego, czyli poniżej 200 nanometrów. W ramach wspieranego przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych(odnośnik otworzy się w nowym oknie) projektu NanoChemBioVision opracowano dwie metody, które pozwalają na osiągnięcie ultrawysokiej rozdzielczości przewyższającej dyfrakcyjną granicę rozdzielczości. „Obie techniki w unikalny sposób pozwalają na osiągnięcie bardzo wysokiej rozdzielczości bez konieczności stosowania znaczników fluorescencyjnych, które zmieniają próbki, barwiąc je lub modyfikując genetycznie”, wyjaśnia Sumeet Mahajan, koordynator projektu z Uniwersytetu w Southampton(odnośnik otworzy się w nowym oknie), uczelni będącej gospodarzem projektu. „Technologia ta mogłaby znaleźć szereg zastosowań biomedycznych, co przyczyniłoby się do poprawy zdrowia publicznego. Rozwiązanie mogłoby na przykład zostać wykorzystane do obrazowania cząstek wirusowych, na przykład SARS-CoV-2, umożliwiając wgląd w ich skład chemiczny i strukturę, co pomogłoby w walce z chorobą”. Do tej pory uzyskano jeden patent, a drugi wniosek właśnie oczekuje na rozpatrzenie.
Szczegółowe informacje na temat komórek bez konieczności stosowania znaczników
Od ostatnich 20 lat obserwujemy gwałtowny rozwój w dziedzinie obrazowania biologicznego, który został zainicjowany odkryciem białka zielonej fluorescencji(odnośnik otworzy się w nowym oknie) i wynalezieniem metod obrazowania optycznego z wykorzystaniem fluorescencji gwarantujących bardzo wysoką rozdzielczość. Badacze w dziedzinie nauk przyrodniczych są dziś w stanie obrazować cechy komórek z niespotykaną wcześniej szczegółowością. Jednak stosowane przez nich znaczniki fluorescencyjne utrudniają obrazowanie niektórych funkcji i cech. Obrazowanie wibracyjne stanowi jedną z metod niewymagającą stosowania znaczników, która dostarcza dodatkowych informacji na temat składu chemicznego i struktury. Wszystkie cząsteczki drgają we właściwy dla siebie sposób. Do ich pomiaru naukowcy z projektu NanoChemBioVision wykorzystali spektroskopię w podczerwieni(odnośnik otworzy się w nowym oknie) i spektroskopię Ramana(odnośnik otworzy się w nowym oknie). Zespół zbadał również inną, niewymagającą stosowania znaczników technikę wykorzystującą generację harmonicznych i dwufotonową fluorescencję, która polega na łączeniu dwóch fotonów w celu uzyskania obrazów określonych struktur i cząsteczek. Naukowcy zastosowali te techniki zarówno do metod opartych na superoscylacji, jak i fotonowych nanowiązkach. Pierwsza metoda umożliwia kształtowanie rozchodzącej się wiązki światła poprzez modulację jej natężenia częstotliwości w celu uzyskania niewielkiej wiązki do obrazowania(odnośnik otworzy się w nowym oknie). Druga z kolei wykorzystuje działanie mikrosfer(odnośnik otworzy się w nowym oknie) na wiązkę. Mikrosfery, wykonane z materiału o większej gęstości niż medium, skupiają światło do punktu o wielkości nanometrycznej. Superoscylacja została wykorzystana w kilku symulacjach z wykorzystaniem standardowych jedno- i wielofotonowych mikroskopów, co pozwoliło w ustaleniu optymalnych parametrów dla modulacji światła. Rezultaty wykazały poprawę rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją o 30 % do 70 % . Na przykład połączenie superoscylacji z obrazowaniem nanocząstek złota za pomocą fluorescencji dwufotonowej(odnośnik otworzy się w nowym oknie) pozwoliło uzyskać rozdzielczość przewyższającą ich dyfrakcyjną granicę rozdzielczości. Technika generacji drugiej harmonicznej wspomagana nanowiązką fotonową została wykorzystana w badaniu takich próbek biologicznych jak włókna kolagenowe w tkance pobranej od myszy, pozwalając na obrazowanie z niespotykaną dotąd szczegółowością. Uzyskano rozdzielczość poniżej 125 nanometrów, czyli 2,3 razy większą niż w przypadku obrazowania ograniczonego zjawiskiem dyfrakcji. Rozwiązanie to wykorzystane zostało także do badania próbek idiopatycznego włóknienia płuc, pomagając w rozpoznaniu choroby. Zaobserwowano wtedy zmiany kolagenowe, które nie były widoczne na obrazach wykonanych za pomocą metod ograniczonych dyfrakcją. Różnice pomiędzy próbkami zdrowych płuc a płuc leczonych były bardzo dobrze widoczne. „Technologia ta przynosi nowe możliwości w zakresie wysoko rozdzielczego obrazowania tkanek i komórek, które nie tylko nie wymaga stosowania znaczników, ale także pozwala na uzyskanie informacji dotyczących składu chemicznego i struktury, co wcześniej nie było możliwe”, mówi Mahajan. Zespół współpracuje obecnie z partnerami z Centrum Badań Optoelektronicznych(odnośnik otworzy się w nowym oknie) w Southampton, by stworzyć metody pozwalające na ograniczenie kosztów i rozmiaru systemów laserowych do obrazowania wielofotonowego. Naukowcy starają się również poprawić czułość urządzenia i rozszerzyć jego możliwości o obrazowanie różnego rodzaju tkanek, komórek i chorób. Zespół pracuje także nad zwiększeniem penetracji, aby umożliwić obrazowanie głębszych warstw tkanek w ultrawysokiej rozdzielczości.
