Weiterentwicklung von Methoden zum Nachweis von Biomolekülen in situ
Krankheitsdiagnosen werden oft durch histopathologische Analysen von bei Biopsien entnommenem Gewebe bzw. Zellen gestellt. Dafür sind hohe Spezifität und Empfindlichkeit notwendig. Die bisher angewendeten Methoden stoßen dabei an ihre Grenzen, sodass verbesserte Verfahren entwickelt werden müssen, mit denen Biomoleküle in situ genau untersucht werden können. Zu diesen Untersuchungen gehören der Häufigkeitsnachweis von Biomolekülen, deren sub-zellluläre Lokalisation und sekundäre Modifikationen sowie das Zusammenspiel mit anderen Molekülen. Das Hauptziel des EU-finanzierten Projekts "Enhanced Ligase based histochemical techniques" (Enlight) lag in der Entwicklung hochempfindlicher und spezifischer Analyseverfahren zur Untersuchung einzelner DNA- und Proteinmoleküle und deren funktionellem Status. Zur Untersuchung der Proteine griffen die Forscher auf das PLA-Verfahren (PLA, Proximity Ligation Assay) und zur Untersuchung der DNA auf sogenannte Padlock Probes zurück. Beide Verfahren wurden erst kürzlich entwickelt und ermöglichen in situ den Nachweis einzelner Biomoleküle in einzelnen Zellen. Beim PLA-Verfahren werden zwei Antikörper an DNA-Oligonukleotide gekoppelt. Die beiden Antikörper befinden sich nah beieinander auf demselben Proteinmolekül. Die DNA-Oligonukleotide verbinden sich miteinander und eine weitere fluoreszierende DNA-Probe wird unter dem Mikroskop untersucht. Das am Enlight-Projekt beteiligte Konsortium entwickelte diese Methode weiter, um Erkenntnisse über einzelne Proteine, ihr Zusammenwirken, ihre Modifikationen und Lokalisation zu gewinnen. Außerdem konnten die Projektpartner ihr Wissen im Bezug auf die Beteiligung einzelner Proteine bei der Entstehung von Krebs und mitochondrialen Krankheiten erweitern, indem sie Reagenzien für den Nachweis von Krebs-Biomarkern entwickelten. DNA-Moleküle, die aus Segmenten mit 20 Nukleotiden bestehen, die komplementär zum Ziel sind und durch eine Verbindungssequenz aus 40 Nukleotiden verbunden sind, werden als Padlock Probes bezeichnet. Sie besitzen eine hohe Sensitivität und können DNA-Moleküle unterscheiden, deren Sequenzen eine große Ähnlichkeit aufweisen. Die Projektpartner optimierten dieses Verfahren dahingehend, dass bei verschiedenen mitochondrialen Genomen selbst Unterschiede von nur einem Nukleotid sowie die Lokalisation in situ nachgewiesen werden kann. Die Quantifizierung der durch die oben aufgeführten Methoden erzeugten Signalintensität wurde mithilfe automatisierter Bildanalyseverfahren vorgenommen. Mit den entwickelten Softwaretools konnten viele Proben untersucht und die objektive Klassifizierung von Molekülen sowie ihre Lokalisation im Gewebe bzw. in Zellen vereinfacht werden. Die Projektergebnisse liefern einzigartige molekulare Hilfsmittel zur Untersuchung einzelner Proteine oder Nukleinsäuren sowie deren funktionellem Status in einzelnen Zellen und Gewebeproben. Eine kommerzielle Nutzung dieser Verfahren hat sicher eine Verbesserung bei der Stellung von Diagnosen und bei der Vorbeugung von Krankheiten zur Folge.
