Postępu detekcji biomolekularnej in situ
Diagnozowanie chorób często polega na analizie histopatologicznej bioptatu tkankowego lub komórkowego i wymaga wysokiej specyficzności i czułości. Stanowi to poważne wyzwanie dla stosowanych obecnie metod i wymaga opracowania doskonalszych technik, które umożliwiają szczegółowe badania biocząsteczek in situ. Tego typu badania obejmują detekcję zagęszczenia biomolekuł, ich subkomórkową lokalizację i modyfikacje wtórne, a także ich interakcje z innymi cząsteczkami. Głównym celem projektu finansowanego ze środków UE "Udoskonalone techniki histochemiczne oparte na ligazie" (Enlight) było opracowanie wysoce czułych i szczegółowych procedur analitycznych, by zbadać określone kwasy nukleinowe i cząsteczki białkowe oraz ich stan funkcyjny. Projekt powstał w oparciu o "oznaczenie ligacji w bliskości" (PLA) do analizy białek oraz "sondowanie kłódkowe" do analizy DNA, dwie wynalezione niedawno technologie, które umożliwiają wykrycie pojedynczych biocząsteczek w pojedynczej komórce i tkance in situ. Korzystając z dwóch przeciwciał połączonych z oligonukleotydami DNA, metoda PLA wykorzystuje bliskość związanych przeciwciał na tej samej cząsteczce białkowej. Oligonukleotydy DNA są następnie grupowane i kolejna fluorescencyjna sonda DNA użyta jest do detekcji pod mikroskopem. Konsorcjum Enlight dopracowało tę metodę, aby przeanalizować pojedyncze proteiny, ich interakcje, modyfikacje i lokalizację. Dodatkowo, opracowując odczynniki do detekcji biomarkerów raka, partnerzy projektu zdobyli nową wiedzę z zakresu biologii na temat roli kilku białek w procesie kancerogenezy i chorobach mitochondrialnych. Sondy "kłódkowe" to cząsteczki DNA składające się z segmentów długości 20 nukleotydów dopełniających obiekt docelowy połączonych sekwencją ogniw o długości 40 nukleotydów. Oferują one wielką czułość i zdolność do rozróżniania między cząsteczkami DNA o wysokim podobieństwie sekwencyjnym. Partnerzy projektu zoptymalizowali tę technologię, by określić różnice rzędu pojedynczego nukleotydu między odmiennymi genomami mitochondrialnymi a ich lokalizacją in situ. Kwantyfikację intensywności sygnałów generowanych przez powyższe metody przeprowadzono z użyciem zautomatyzowanych procedur analizy obrazu. Opracowane narzędzia programowe umożliwiły przetwarzanie wielu próbek i ułatwiły nieobciążoną klasyfikację cząsteczek i ich lokalizacji w tkankach i komórkach. Produkty uzyskane w ramach projektu stanowią wyjątkowe narzędzia molekularne do badania pojedynczych protein lub klasów nukleinowych oraz ich stanu funkcyjnego w pojedynczych komórkach i próbkach klinicznych. Oczekuje się, że komercyjne wykorzystanie tych technik usprawni diagnozowanie chorób i, miejmy nadzieję, zapobieganie chorobom.
