Avanzamento nella rivelazione di biomolecole in situ
La diagnosi della malattia si basa spesso sull'analisi istopatologica della biopsia di tessuti o di cellule e richiede un'elevata specificità e sensibilità. Ciò pone una grande sfida per gli attuali metodi e richiede lo sviluppo di tecniche migliori che consentano studi dettagliati delle biomolecole in situ. Tali studi comprendono il rilevamento di un'abbondanza biomolecolare, la localizzazione subcellulare e modifiche secondarie, nonché la loro interazione con altre molecole. Scopo principale del progetto Enlight (ʺEnhanced Ligase based histochemical techniquesʺ), finanziato dall'UE, è stato di sviluppare procedure di analisi altamente sensibili e specifiche per lo studio individuale degli acidi nucleici e delle molecole proteiche, nonché del loro stato funzionale. Il progetto è stato basato sulla tecnologia di analisi della proteine rappresentata dal ʺsaggio di legazione di prossimitàʺ (PLA) e sulla ʺsonda lucchettoʺ per l'analisi del DNA, due tecnologie di recente invenzione che consentono la biorivelazione di una singola molecola in singole cellule e tessuti in situ. Utilizzando due anticorpi accoppiati a oligonucleotidi di DNA, il metodo PLA sfrutta la vicinanza gli anticorpi legati sulla stessa molecola proteina. Gli oligonucleotidi di DNA vengono successivamente uniti insieme e viene utilizzata un'altra sonda di DNA fluorescente per la rivelazione al microscopio. Il consorzio Enlight ha raffinato questo metodo al fine di analizzare le interazioni, le modifiche e la localizzazione delle singole proteine. Inoltre, attraverso lo sviluppo di reagenti per l'individuazione di biomarcatori tumorali, i partner del progetto sono riusciti ad acquisire nuove conoscenze biologiche sul ruolo di varie proteine nelle malattie di carcinogenesi e mitocondriali. Le sonde lucchetto sono molecole di DNA costituite da segmenti complementari al bersaglio collegate da una sequenza nucleotidica di unione avente una lunghezza di 40 nucleotidi. Queste offrono un'elevata sensibilità e sono in grado di distinguere molecole di DNA al alta similarità di sequenza. I partner del progetto hanno ottimizzato tale tecnologia al fine di distinguere le differenze di un singolo nucleotide tra i diversi genomi mitocondriali, oltre alla loro localizzazione in situ. La quantificazione dell'intensità dei segnali generati dai metodi appena descritti è stata eseguita utilizzando procedure automatizzate di analisi dell'immagine. Gli strumenti software sviluppati hanno permesso l'elaborazione di molti campioni, facilitando la classificazione imparziale delle molecole e la loro localizzazione nei tessuti o nelle cellule. L'applicabilità degli esiti del progetto è costituita da strumenti molecolari esclusivi per lo studio delle singole proteine o dei singoli acidi nucleici, nonché del loro stato funzionale in singole cellule e campioni clinici. Si prevede che lo sfruttamento commerciale di tali tecniche possa migliorare la diagnosi e, auspicabilmente, la prevenzione delle malattie.
