Wyjaśnienie szlaku MAPK
Finansowany ze środków UE projekt MAPKMOOD zbadał szlak MAPK, wykorzystując modele zwierzęce i kultury komórek. W celu przeprowadzenia tych badań naukowcy opracowali białka fuzyjne estrogenowego receptora T2 (ERT2), aby umożliwić odwracalną aktywację genu i hamowanie podawania leku w postaci 4-hydroksytamoksyfenu (4OHT). Aktywności zewnątrzkomórkowych kinaz regulowanych sygnałem (ERK) i fosfataz MAPK (MKP) zbadano również poprzez stymulację z wykorzystaniem 4OHT i 12-mirystynianu, 13-octanu forbolu (PMA). Linie komórkowe cechujące się specyficznymi mutacjami białek (Braf, V637E i K519M) opracowano za pomocą ERT2, aby utworzyć białka fuzyjne umożliwiające zewnętrzną modulację genu za pomocą 4OHT. Kultury komórkowe BrafV637E–ERT2 cechowały się znacząco zwiększonymi poziomami aktywowanych, fosforylowanych kinaz ERK1 i ERK2 (pERK1/2) po podaniu 4OHT. W przypadku PMA po podaniu 4OHT zanotowano obniżenie aktywności pERK1/2 na szlakach MAPK kultur komórkowych BrafK519M–ERT2, podczas gdy leczenie samym PMA przywróciło aktywację ERK. Barwienie immunologiczne potwierdziło stymulacyjną i hamującą rolę OHT dla szlaku sygnalizacji MAPK. Podobne wyniki uzyskano u fibroblastów poprzez ekspresję białek fuzyjnych MKP1C258S–ERT2 lub MKP1WT–ERT2. Eksperymenty te ostatecznie potwierdziły, że białka fuzyjne ERT2 mogą odwracalnie kontrolować sygnalizację MAPK oraz poziomy enzymu kinazy za pomocą 4OHT. Naukowcy uczestniczący w projekcie MAPKMOOD z powodzeniem opracowali modele podwójnie transgenicznych myszy poprzez skrzyżowanie myszy BrafV637E–ERT2 z myszami Nestin-Cre i Rosa-cre dla potrzeb badań in vivo. Myszy BrafV637E–ERT2 x Nestin-cre cechowały się ekspresją białek fuzyjnych BrafV637E–ERT2 wyłącznie w mózgu, w przeciwieństwie do myszy BrafV637E–ERT2 x Rosa-cre. Aktywowane poziomy kinaz ERK1 i ERK2 zaobserwowano po leczeniu 4OHT w różnych punktach czasowych, przy powrocie do linii podstawowej po 24 godzinach, co zostało potwierdzone przez analizę metodą western blot. Zgodnie z oczekiwaniami myszy BrafV637E–ERT2 x Nestin-cre cechowała silna ekspresja białek fuzyjnych tylko w mózgu. Myszy BrafV637E–ERT2 x Rosa-cre cechowała silna aktywacja sygnalizacji MAPK we wszystkich badanych organach. Krótko mówiąc, naukowcy z powodzeniem kontrolowali sygnalizację MAPK poprzez regulację aktywności fosfatazy oraz regulację poziomów enzymu kinazy na poziomie komórkowym i jądrowym za pomocą leczenia 4OHT. W ten sposób utworzono silne narzędzie do badania ostrych lub przewlekłych skutków zmiany kinazy w różnych stanach rozwojowych, organach i liniach komórkowych. Wyjaśni to rolę funkcji MAPK w zdrowiu i chorobie oraz zapewni nowe cele dla terapii.
