Multiphoton Voltage Imaging

Opis projektu

W grupie siła – zastosowanie trzech fotonów może poprawić obrazowanie potencjału czynnościowego

Mózg to złożony obwód elektryczny, który wykorzystuje zmiany w napięciu w błonach komórkowych w celu sygnalizacji. Wielokrotnie próbowano już zbadać elektrofizjologię obwodów w mózgu za pomocą różnych technik – od rejestrowania aktywności za pomocą elektrod po wykorzystanie napięciowoczułych barwników. Genetycznie kodowane sondy napięcia (ang. genetically encoded voltage indicators, GEVI) to wschodząca technologia monitorowania dynamiki napięcia elektrycznego. Te sztucznie wytwarzane białka pełniące rolę czujników reagują na zmiany napięcia, zmieniając jasność emitowanego przez siebie światła. Zespół finansowanego przez UE projektu MULTIVIsion chce rozwinąć możliwości GEVI za pomocą obrazowania trzyfotonowego. Obrazowanie trzyfotonowe opiera się na jednoczesnej interakcji trzech fotonów z fluorescencyjną cząsteczką, powodując jej wzbudzenie do większego napięcia niż ma to miejsce w przypadku obrazowania dwu- lub jednofotonowego. Wykorzystanie dłuższych fal zwiększyło precyzję technologii i pozwoliło na uzyskanie wyraźniejszych obrazów, nawet w przypadku tkanek głębokich. Szczegółowy obraz potencjału czynnościowego może pomóc w wyjaśnieniu procesów uczenia się i zapamiętywania na poziomie pojedynczych neuronów.

Cel

Understanding the brain is one of the great scientific challenges of our time. This pursuit fundamentally depends on advances in physical sciences and engineering to provide novel tools and methods to perturb, record and interpret brain activity.
Information in the brain is encoded in changes in the voltage across the membrane of brain cells. Voltage imaging with genetically encoded voltage indicators (GEVIs) is a revolutionary method that allows faithful recording of the fast electrical dynamics of many genetically targeted cells in parallel. This provides an unprecedented means to record how patterns of change in this membrane voltage, called action potentials, manifest in subcellular compartments, cells, and networks across the brain, which is the only way to arrive at a fundamental understanding of brain functions like learning and memory, and of neurogenerative diseases. For this promise to be fulfilled, we need voltage imaging deep in the living brain of awake and behaving organisms. To achieve this, I will evolve a GEVI optimized for three-photon (3P) imaging, by screening mutant libraries of GEVIs directly for brightness and photostability under 3P-excitation, voltage sensitivity, and membrane trafficking in neurons. I will optimize the photocycle dynamics of GEVIs with temporally structured light, using a NOPA with tunable repetition rate, pockels cell and multiple optical delay lines, to create optimal 3P excitation protocols. Crucially, this optimization will not depend on spectral phase and is therefore compatible with high speed multiphoton imaging, aberration correction, and deep tissue imaging. Finally, I will investigate memory formation in a proof-of-principle experiment. I will use a custom microscope I developed, for 3P voltage imaging of cells in the cerebellum of mice trained in an eyeblink task. Memory formation in this paradigm is hypothesized to look like subtle changes in the exact shape and timing of action potentials, which I will resolve.