Opis projektu
Mechanizm aktywacji helikazy w inicjacji replikacji eukariotycznego DNA
Replikacja eukariotycznego DNA rozpoczyna się od helikazy utrzymującej minichromosom (MCM), otaczającej dwuniciowy DNA (dsDNA) jako nieaktywny podwójny heksamer. Aktywacja jest napędzana przez zależne od kinazy tworzenie kompleksu białkowego Cdc45 MCM-GINS, który otacza pojedynczą nić DNA (ssDNA) i odwija dsDNA. Zespół finansowanego ze środków działania „Maria Skłodowska-Curie” projektu MechHelicaseActiv8on będzie badał przejście topologiczne między nieaktywnym i aktywnym stanem helikazy, gdy między dwiema podjednostkami w sposób regulowany otwiera się helikaza pierścieniowego MCM. Wykorzystując różne strategie sieciowania w połączeniu ze spektrometrią mas i kriogeniczną mikroskopią elektronową, zespół zbada trajektorie wyrzutu ssDNA z centralnego kanału helikazy oraz rolę kompleksu białkowego w aktywacji helikazy.
Cel
The initiation of DNA replication requires dynamic biomolecular interactions, which are temporally and spatially regulated to allow genome duplication only once per cell cycle. During eukaryotic replication initiation, the MCM helicase is loaded as an inactive double hexamer encircling double-stranded DNA (dsDNA). It is activated by a set of proteins called firing factors in a kinase-dependent manner, thereby forming the CMG complex (Cdc45, MCM, GINS), which encircles single-stranded DNA (ssDNA) and thus can unwind dsDNA. Although the essential components for helicase activation are known, we do not understand the remarkable topological transition between the inactive helicase encircling dsDNA and the active helicase encircling ssDNA. For this to happen, the ring-shaped MCM helicase must open between two subunits in a regulated manner. Therefore, I aim to (1) uncover the trajectory of ssDNA ejection from the helicase central channel and (2) dissect the role of firing factors in helicase activation. The objectives of the proposal are to determine (i) which helicase subunit interface has to open to eject ssDNA, (ii) which region of helicase interacts with ssDNA during helicase activation, (iii) what is the topology of helicase activation intermediates and (iv) which firing factors interact with ssDNA during strand ejection. I will employ biochemistry with various crosslinking strategies combined with mass spectrometry to characterize the dynamics of protein-protein and protein-DNA interactions during helicase activation. Using cryogenic-Electron Microscopy (cryo-EM), I will investigate the structure of intermediates of helicase activation. MCM helicase subunits and firing factors are conserved from yeast to humans, and their increased expression is correlated with poor survival in cancer patients. Since flexible interfaces of protein-protein interactions are promising drug target, results obtained during this project will facilitate anticancer drug design.
Dziedzina nauki
- natural sciencesbiological sciencesbiochemistrybiomoleculesproteinsproteomics
- medical and health sciencesbasic medicinemedicinal chemistry
- natural sciencesbiological sciencesgeneticsDNA
- medical and health sciencesclinical medicineoncology
- natural scienceschemical sciencesanalytical chemistrymass spectrometry
Słowa kluczowe
Program(-y)
Temat(-y)
System finansowania
MSCA-IF - Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowships (IF)Koordynator
NW1 1AT London
Zjednoczone Królestwo